Poiché le persone prestano sempre più attenzione alle preoccupazioni relative alla salute, il campo della diagnostica in vitro (IVD) si sta sviluppando rapidamente. In particolare, l'emergere del COVID-19 ha accelerato l'espansione del mercato IVD. Attualmente, RT-qPCR è stato ampiamente utilizzato nello sviluppo di prodotti reagenti diagnostici IVD, ma i reagenti diagnostici liquidi RT-qPCR hanno costi di trasporto elevati, prestazioni instabili e breve durata di conservazione. I reagenti essiccanti possono aggirare perfettamente le carenze dei reagenti diagnostici liquidi RT-qPCR. Quindi, come dovrebbero essere realizzati i reagenti essiccanti? Come scegliere il metodo di produzione?

1. Cosa sono i reagenti essiccanti?

2. Che cosa è l'essiccazione all'aria?

3. Che cosa è la liofilizzazione?

4. Qual è la differenza tra liofilizzazione ed essiccazione all'aria?

5. Prodotti correlati e prestazioni

1. Cosa sono i reagenti essiccanti?

I reagenti essiccanti sono i reagenti ottenuti dopo che il campione è stato essiccato e disidratato. I reagenti essiccanti possono essere consegnati a temperatura ambiente e non richiedono il trasporto a catena del freddo. Possono evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti dei reagenti per influenzare le prestazioni e la durata di conservazione dei reagenti e ridurre notevolmente i costi di trasporto. Non solo sono facili da usare per le persone, ma riducono anche le richieste per gli operatori. L'industria della diagnostica molecolare è interessata ai reagenti essiccanti principalmente perché possono essere trasportati e conservati a temperatura ambiente. Esistono ora due tecniche di essiccazione ampiamente utilizzate: liofilizzazione ed essiccazione ad aria. La tecnologia di essiccazione ad aria è meno costosa, mentre la tecnologia di liofilizzazione è la più popolare, entrambe con i loro vantaggi. Esistono due metodi di produzione dei reagenti essiccanti: essiccazione ad aria e liofilizzazione. Quali sono e come si dovrebbe scegliere?

2. Che cosa è l'essiccazione all'aria?

L'essiccazione ad aria è una tecnica di essiccazione che può essere utilizzata per preparare reagenti di essiccazione. L'essiccazione ad aria è divisa in tre processi: essiccazione ad aria naturale, essiccazione ad aria calda ed essiccazione ad aria naturale imitazione. Nel processo di produzione industriale, per garantire la stabilità della qualità e dell'output del prodotto, il reagente viene spesso essiccato con essiccazione ad aria calda. Per i reagenti diagnostici IVD, viene generalmente utilizzato un forno di precisione con una funzione di soffiaggio o vuoto per essiccare il liquido a una temperatura superiore alla temperatura ambiente (essiccazione a 50 °C per 80 minuti). Il liquido viene essiccato ad aria in un materiale secco viscoso. Il processo specifico è mostrato nella Figura 1.

Fig 1. Essiccazione ad aria calda

La chiave per essiccare i reagenti molecolari liquidi non è solo garantire che l'enzima possa essere rapidamente idratato dopo l'essiccazione, ma anche garantire che la stabilità, la sensibilità e la specificità dei reagenti essiccati non vengano influenzate. L'essiccazione ad aria richiede solo un forno di precisione. Rispetto alla liofilizzazione, l'attrezzatura è più economica e il consumo di energia è inferiore, quindi il costo dei reagenti è inferiore. Inoltre, il processo di essiccazione ad aria è semplice e il tempo di essiccazione è più breve (entro 2 ore). L'essiccazione ad aria presenta sia vantaggi che svantaggi. Durante il processo di essiccazione ad aria, vari componenti, inclusi gli enzimi, andranno persi con l'evaporazione dell'acqua. Non solo, ma anche la soluzione di reazione e i suoi componenti saranno danneggiati dall'alta temperatura di 50 °C. Alcuni componenti si ossidano anche più facilmente, quindi la durata di conservazione dei reagenti essiccati ad aria sarà più breve. Inoltre, il reagente essiccato ad aria ha una forte viscosità ed è facile da appendere al muro, e ha una scarsa capacità di reidratazione.La liofilizzazione può compensare gli svantaggi dell'essiccazione all'aria.

3. Che cosa è la liofilizzazione?

Diversamente dall'essiccazione ad aria, la liofilizzazione è una speciale tecnologia di essiccazione, il cui principio di base si basa sul cambiamento trifase dell'acqua. Le tre fasi dell'acqua sono solido, liquido e gassoso e le tre fasi possono coesistere e trasformarsi a vicenda. Quando la pressione è maggiore di 610,75 Pa, con l'aumento della temperatura, il ghiaccio si scioglie in acqua e l'acqua evapora e si trasforma in vapore. Quando la pressione è inferiore a 610,75 Pa, il ghiaccio viene direttamente sublimato in vapore acqueo tramite riscaldamento. Specificamente come mostrato nella Figura 2. La liofilizzazione utilizza il principio della transizione di fase dell'acqua. Innanzitutto, i reagenti liquidi vengono congelati a -30℃~-40℃, in modo che la maggior parte dell'umidità nel materiale venga congelata in ghiaccio. Il ghiaccio viene sublimato in vapore acqueo a un vuoto più elevato, fornendo una fonte di calore a bassa temperatura. Il vapore acqueo viene condensato da un condensatore nel sistema del vuoto in modo che altro materiale rimanga nel ghiaccio, ottenendo così prodotti essiccati.

Fig 2. Diagramma di fase per l'acqua

Quali sono quindi le principali forme di reagenti liofilizzati? I reagenti liofilizzati IVD sono principalmente divisi in tre forme: liofilizzazione in flacone di penicillina, liofilizzazione in situ e microsfere liofilizzate. Le tre formulazioni liofilizzate sono illustrate nella Figura 3. Le diverse forme hanno i loro vantaggi e svantaggi. La liofilizzazione in flacone di penicillina è la forma più industrializzata. Non solo ha linee di produzione completamente automatiche, ma ha anche un processo completo di verifica e controllo del rischio. Il processo è il più semplice e il più maturo. Lo svantaggio è che il costo di un flacone di penicillina è elevato e la quantità di riempimento non dovrebbe essere troppo piccola. Tuttavia, la quantità di ciascun reagente IVD è molto piccola, quindi deve essere riempito per più porzioni o utilizzato più volte alla volta. Se non viene utilizzato, deve essere conservato separatamente e la praticità è carente.

La liofilizzazione in situ significa che tutti i componenti del reagente vengono liofilizzati direttamente nel kit, il che è più comodo da usare. Tuttavia, la distribuzione del freddo e del calore nel liofilizzatore è distorta e anche il posizionamento dei kit è diverso, quindi la consistenza dei lotti è difficile da controllare. Inoltre, il tasso di utilizzo dei liofilizzatori in situ è ​​molto basso, quindi il costo di ammortamento è elevato. Se viene eseguita una grande quantità di liofilizzazione in situ, le polveri liofilizzate saranno contaminate in modo incrociato.

Fig 3. Forma dei reagenti liofilizzati

La microsfera liofilizzata può raggiungere una quantificazione accurata, una persona singola e una porzione singola, il prodotto è più comodo da usare. Può anche essere trattata con uno speciale processo per prevenire l'assorbimento di umidità, ottenere la conservazione a temperatura ambiente e risolvere più punti critici contemporaneamente. Lo svantaggio è che lo sviluppo della tecnologia della microsfera liofilizzata è difficile e il requisito per il controllo del processo è elevato. I reagenti liofilizzati devono scegliere la forma migliore in base alle scene di applicazione. La microsfera liofilizzata ha vantaggi unici ed è adatta a una varietà di scene di applicazione, che sono più promettenti sul mercato.

4. Qual è la differenza tra liofilizzazione ed essiccazione all'aria?

Il processo unico di liofilizzazione determina i suoi vantaggi unici. Rispetto all'essiccazione ad aria, la liofilizzazione è superiore all'essiccazione ad aria sotto molti aspetti. I vantaggi della liofilizzazione sono i seguenti:

La liofilizzazione viene effettuata a bassa temperatura, in modo che l'enzima non venga denaturato o perda attività biologica e l'attività biologica sia completa.Poiché l'essiccazione viene eseguita in uno stato congelato, il volume dei reagenti di essiccazione è quasi invariato e la struttura originale viene mantenuta senza restringimento. Quando si essicca a bassa temperatura, la perdita di alcuni componenti volatili nei reagenti di essiccazione è molto piccola, il che è adatto per l'essiccazione dei reagenti. I sali inorganici non verranno precipitati sulla superficie del materiale durante l'essiccazione, evitando l'indurimento superficiale del materiale. Il materiale essiccato è sciolto e poroso, si dissolve rapidamente e completamente dopo l'aggiunta di acqua e ripristina il suo carattere originale quasi immediatamente. Poiché l'essiccazione viene eseguita sotto vuoto con pochissimo ossigeno, alcune sostanze facilmente ossidabili sono protette. L'essiccazione può rimuovere oltre il 95% al ​​99% dell'umidità in modo che i prodotti essiccati possano essere conservati a lungo senza deterioramento.

Le principali differenze tra liofilizzazione ed essiccazione all'aria sono le seguenti:

Tabella 1. Differenze tra liofilizzazione ed essiccazione all'aria

Sebbene i reagenti liofilizzati costino di più e richiedano più tempo, i reagenti prodotti tramite liofilizzazione sono più stabili e più facili da usare, il che è esattamente in linea con la direzione di sviluppo dei reagenti diagnostici. Pertanto, dall'avvento di questa tecnologia, è diventata sempre più popolare. È stata ampiamente utilizzata in vari campi come il rilevamento di malattie, il rilevamento di virus e agenti patogeni, il rilevamento della sicurezza alimentare, il rilevamento di animali e il rilevamento ambientale.

5. Prodotti correlati e prestazioni

Le materie prime nei reagenti diagnostici IVD sono la chiave.I materiali non liofilizzati non possono essere rimossi direttamente dai materiali liofilizzati e ogni componente deve essere sottoposto a screening e debugging. Pertanto, Yeasen Biotechnology sta aumentando costantemente gli investimenti in questo aspetto e si impegna a fornire ai clienti materie prime liofilizzate stabili e di alta qualità, che vengono rapidamente immesse sul mercato.

I prodotti correlati che Yeasen può fornire sono mostrati nella Tabella 2:

Tabella 2. Elenco dei prodotti

Il kit Hieff Unicon® V Lyo-nCoV Multiplex One Step RT-qPCR (con MgCl2) (Cat#13775) è un reagente diagnostico liquido privo di glicerolo, compatibile con la liofilizzazione (lyo-ready). Questo prodotto è la scelta ideale per lo sviluppo di RT-qPCR multiplex che ha stabilità a temperatura ambiente e può essere spedito e conservato a temperatura ambiente.

Prestazioni: il modello pseudovirus è stato amplificato da più RT-qPCR utilizzando reagenti liquidi (rosso) e 13775 reagenti liofilizzati (viola) rispettivamente. Il grafico a sinistra è il canale FAM, quello a destra è il canale VIC. I risultati hanno mostrato che l'attività dei 13775 reagenti era intatta dopo la liofilizzazione e aveva ancora una capacità di reazione multipla ad alta efficienza. Specificamente come mostrato nella Figura 4.

Fig 4. Le prestazioni del prodotto 13775 dopo la liofilizzazione

I 13775 reagenti liofilizzati sono stati posti a 37°C (verde) e -20°C (blu) per 21 giorni per molteplici test di amplificazione RT-qPCR. Il grafico a sinistra è il canale FAM, quello a destra è il canale VIC. I risultati hanno mostrato che il reagente liofilizzato aveva ancora un buon effetto di amplificazione dopo essere stato posto a 37°C per 21 giorni. In particolare, come mostrato nella Figura 5.

Fig 5. Stabilità termica del reagente liofilizzato 13775: 37°C per 21 giorni.

6.Guida alla selezione dei prodotti

Processo	Descrizione	Nome del prodotto	Codice Prodotto
Elaborazione del campione	Digestione delle proteine	Proteinasi K	10401ES
	Estrazione dell'RNA	DNasi I ricombinante (RNasi-free)	10325ES
	Inibizione della RNasi	Inibitore della RNasi murina (40 U/μL)	10603ES
Trascrizione inversa	Adatto per RT-qPCR	Trascrittasi inversa Hifair V (200U/μL)	11300ES
		Trascrittasi inversa Hifair V (600U/μL) senza GLyceroL	11301ES
Amplificazione PCR	DNA polimerasi a caldo	Hieff UNICON Hotstart E-Taq DNA polimerasi	10726ES

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