La PCR quantitativa fluorescente (qPCR) è una tecnica comunemente utilizzata nei laboratori, che può essere applicata all'analisi dell'espressione genica, alla genotipizzazione, al rilevamento di patogeni, all'analisi SNP e altro ancora. Il funzionamento della qPCR è semplice e il suo principio è facile da capire. Ora, di fronte a una pila di dati disordinati, come analizzare i risultati diventa un compito arduo. Oggi, Xiao Yi ti guiderà su come semplificare processi complessi e ottenere facilmente dati che possono essere pubblicati su riviste SCI!
I metodi di analisi comuni utilizzati in qPCR includono la quantificazione relativa e la quantificazione assoluta, e la scelta tra questi metodi dovrebbe basarsi su diversi progetti sperimentali. In questo numero, ci concentreremo su un'applicazione comune di qPCR: l'analisi dell'espressione genica, in cui viene generalmente selezionato il metodo di quantificazione relativa.
Progettazione sperimentale
Supponiamo di dover studiare l'effetto dell'induzione luminosa sull'espressione del gene Arabidopsis AtSUC2. Il gruppo di controllo sarebbe costituito da piante Arabidopsis che non hanno subito alcun trattamento, mentre il gruppo sperimentale sarebbe costituito da piante che sono state trattate con una certa induzione luminosa. L'RNA verrebbe estratto da entrambi i gruppi e sottoposto a trascrizione inversa per ottenere cDNA, che verrebbe quindi utilizzato come modello. Il gene Arabidopsis GAPDH verrebbe selezionato come riferimento interno per l'esperimento qPCR.
I pozzetti qPCR che devono essere allestiti sono i seguenti:
1) NTC (No Template Control) viene utilizzato per verificare se vi è contaminazione nel sistema PCR.
2) NRT (Nessuna trascrizione inversa) si riferisce all'utilizzo di RNA che non ha subito trascrizione inversa come modello, che serve da controllo per la contaminazione del gDNA.
3) Il gene di riferimento interno viene utilizzato per correggere le differenze causate dalle diverse concentrazioni iniziali dei campioni.
4) La selezione di campioni di controllo rientra generalmente nelle seguenti categorie:
- Per valutare l'effetto di un determinato trattamento sull'espressione genica, il campione non trattato viene utilizzato come campione di riferimento.
- Per rilevare le differenze nell'espressione genica in momenti diversi, il campione al tempo 0 viene utilizzato come campione di riferimento.
- Per confrontare le differenze nell'espressione genica tra diversi tessuti, un tessuto viene selezionato arbitrariamente come campione di riferimento.
Un punto da notare qui è che per ogni materiale menzionato sopra, sono stati allestiti 3 pozzetti PCR (1, 2, 3). Questi sono duplicati PCR, noti anche come repliche tecniche, che hanno lo scopo di eliminare errori operativi e valutare accuratamente l'efficienza di amplificazione. Inoltre, devono essere stabilite repliche biologiche, il che implica la conduzione dello stesso esperimento su materiali diversi (tempi, piante, lotti, piastre di reazione diversi) per calibrare la variabilità biologica e analizzare se il trattamento ha significatività statistica. Specificamente in questo caso, sia il gruppo sperimentale che il gruppo di controllo richiedono almeno altri due set di campioni di Arabidopsis (A, B, C) da elaborare. L'RNA viene estratto da ogni set e sottoposto a trascrizione inversa, seguito da qPCR. Per l'analisi statistica, viene utilizzata la media delle tre repliche biologiche.
Analisi dei risultati — Metodo ΔΔCt
La caratteristica del metodo ΔΔCt è che si basa esclusivamente sui valori Ct per il calcolo, ma la premessa è che l'efficienza di amplificazione del gene target e del gene di riferimento debba essere relativamente coerente ed entrambi compresi nell'intervallo del 90-110%.
La formula di calcolo specifica è la seguente:
ΔCt = Ct (gene bersaglio) - Ct (gene di riferimento)
ΔΔCt = ΔCt (gruppo sperimentale) - ΔCt (gruppo di controllo)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
Supponendo che l'esperimento di cui sopra studi l'effetto dell'induzione della luce sull'espressione del gene Arabidopsis AtSUC2, i risultati del qPCR sono i seguenti:
Durante il calcolo, calcoliamo prima la media dei dati 2^-△Ct per il gruppo di controllo (come mostrato nella figura sopra, che è 0,00116). Quindi, dividiamo ogni valore di 2^-△Ct per questa media per ottenere il valore di 2^-△△Ct. Infine, organizziamo questi valori per ottenere la media e la deviazione standard, indicando che il livello di espressione del gene target nel gruppo sperimentale è aumentato di circa 9,73 volte rispetto al gruppo di controllo.
I risultati vengono rappresentati graficamente utilizzando il software Graphpad come segue:
Il valore P calcolato utilizzando il t-test del software è 0,0024, ovvero inferiore a 0,05, il che indica una differenza statisticamente significativa e risultati affidabili.
Analisi dei risultati — Metodo della curva standard doppia
Nelle applicazioni pratiche, poiché l'efficienza di amplificazione del gene target e del gene di riferimento è spesso diversa, è necessario riprogettare i primer e ottimizzare le condizioni di reazione per ottenere la stessa efficienza di amplificazione. Tuttavia, possiamo anche scegliere un metodo più conveniente, l'approccio della curva dual-standard.
Qui, comprendiamo prima il metodo di analisi della quantificazione assoluta. I passaggi specifici sono amplificare il frammento target tramite PCR, quindi inserire il frammento target in un vettore di clonazione, estrarre il plasmide ricombinante e, dopo che il sequenziamento conferma che è corretto, può essere utilizzato come standard. La quantità di DNA plasmidico può essere misurata utilizzando strumenti come Nanodrop e il numero di copie viene convertito in copie specifiche del plasmide utilizzando la formula di conversione del numero di copie. Dopodiché, il DNA viene amplificato seguendo una serie di diluizioni. Viene tracciata una curva standard con il logaritmo del numero di copie standard come asse x e i valori Ct misurati come asse y. Sulla base del valore Ct del campione sconosciuto, è possibile calcolare il suo numero di copie assoluto.
Formula per il calcolo del numero di copie:
Numero di copie = (massa ÷ massa molecolare relativa) × 6,02 × 10^23
Il metodo della curva dual-standard prevede la costruzione separata di campioni standard per il gene target e il gene di riferimento, l'esecuzione di una quantificazione assoluta e la creazione di curve standard. Dopo aver calcolato il numero assoluto di copie dei campioni sconosciuti, viene effettuato un confronto, offrendo così una maggiore accuratezza.
La formula di calcolo specifica è la seguente:
Q = Numero di copie del gene bersaglio / Numero di copie del gene di riferimento
RQ = Q (sperimentale) / Q (controllo)
Nell'esperimento menzionato sopra, che indaga l'effetto dell'induzione luminosa sull'espressione del gene Arabidopsis AtSUC2, sono stati costruiti campioni standard sia per AtSUC2 che per GAPDH e sono state preparate le seguenti curve standard:
I valori Ct per il gene bersaglio e il gene di riferimento interno nei campioni da testare sono i seguenti:
Durante il calcolo, prima, i valori Ct del gene target e del gene di riferimento interno vengono sostituiti nella relazione lineare della curva standard per ottenere i numeri di copie assoluti del gene target e del gene di riferimento interno sia nel gruppo sperimentale che in quello di controllo. Quindi, utilizzando la formula Q = numero di copie del gene target / numero di copie del gene di riferimento, il livello di espressione del gene target viene normalizzato.Infine, secondo la formula RQ = Q (sperimentale) / Q (controllo), si calcola che RQ sia 9,71, il che indica che il livello di espressione del gene bersaglio nel gruppo sperimentale è 9,71 volte superiore a quello del gruppo di controllo.
I risultati vengono rappresentati graficamente utilizzando il software GraphPad come segue:
Il valore P calcolato utilizzando il t-test del software è 0,0008, ovvero inferiore a 0,05, il che indica una differenza statisticamente significativa e risultati affidabili.
Con questo si conclude l'analisi dei dati qPCR per questa sessione. Successivamente, consiglierò una gamma di prodotti convenienti per garantire che i tuoi dati sperimentali siano più accurati e affidabili. Vieni a ritirarli!
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