Il valore Ct è una rappresentazione di esito cruciale nella PCR quantitativa fluorescente. Viene utilizzato per calcolare le differenze nei livelli di espressione genica o nei numeri di copie geniche. Quindi, quale intervallo di valori Ct può essere considerato ragionevole nella quantificazione fluorescente? Come possiamo garantire che i valori Ct rientrino in un intervallo efficace? Oggi, lasciamo che Xiao Yi risponda a questa domanda per tutti.
Cos'è il valore Ct?
Nel processo di amplificazione qPCR, il valore Ct si riferisce al numero di cicli di amplificazione (soglia di ciclo) in cui il segnale di fluorescenza del prodotto amplificato raggiunge la soglia di fluorescenza impostata. "C" sta per ciclo e "T" sta per soglia. In termini semplici, il valore Ct è il numero di cicli necessari al modello iniziale in qPCR per raggiungere una certa quantità di prodotto, che verrà spiegato più avanti.
Qual è la funzione del valore Ct?
1. Relazione tra amplificazione esponenziale, quantità di template e valore Ct
In uno scenario ideale, durante la qPCR, i geni vengono amplificati esponenzialmente e si accumulano in un certo numero di cicli. La relazione tra il numero di cicli di amplificazione e la quantità di prodotto può essere espressa come: quantità di prodotto amplificato = quantità iniziale del modello × (1 + En)^numero di cicli. Tuttavia, le reazioni qPCR non sempre si verificano in condizioni ideali. Quando la quantità di prodotto amplificato raggiunge una "certa quantità di prodotto", il numero di cicli a questo punto è il valore Ct, che indica il periodo di amplificazione esponenziale. La relazione tra il valore Ct e la quantità iniziale del modello è la seguente: esiste una relazione lineare tra il valore Ct di un modello e il logaritmo del numero di copie iniziale di quel modello. Una maggiore concentrazione del modello iniziale determina un valore Ct inferiore, mentre una minore concentrazione del modello iniziale determina un valore Ct superiore.
2. Curva di amplificazione, soglia di fluorescenza e una certa quantità di prodotto
La quantità di prodotti di amplificazione qPCR è rappresentata direttamente sotto forma di segnali di fluorescenza, noti come curva di amplificazione. Nelle fasi iniziali della PCR, quando l'amplificazione è in condizioni ideali e il numero di cicli è basso, l'accumulo di prodotti è minimo e il livello di fluorescenza prodotto non è significativamente distinguibile dal rumore di fluorescenza di fondo. Successivamente, la produzione di fluorescenza entra nella fase esponenziale. La quantità di prodotto PCR può essere rilevata a un certo punto quando la reazione sta appena entrando nella fase esponenziale, che è definita "quantità di prodotto certa". Questo può essere utilizzato per dedurre il contenuto iniziale del modello. Pertanto, l'intensità del segnale di fluorescenza corrispondente alla quantità di prodotto certa è nota come soglia di fluorescenza.
Nelle fasi successive della PCR, la curva di amplificazione non presenta più un'amplificazione esponenziale ed entra nella fase lineare e nella fase di plateau.
3. La riproducibilità dei valori Ct
Quando i cicli di PCR raggiungono il numero di cicli in cui si verifica il valore Ct, sta semplicemente entrando nella vera fase di amplificazione esponenziale. A questo punto, gli errori minori non sono stati amplificati, quindi la riproducibilità dei valori Ct è eccellente. Ciò significa che, indipendentemente dal fatto che lo stesso modello venga amplificato in tempi diversi o in provette diverse contemporaneamente, i valori Ct ottenuti rimangono costanti.
Qual è l'intervallo dei valori Ct?
1. Efficienza di amplificazione En
L'efficienza di amplificazione della PCR si riferisce all'efficienza con cui la polimerasi converte il gene bersaglio in prodotti di amplificazione.L'efficienza di amplificazione è del 100% quando una molecola di DNA viene convertita in due molecole di DNA. L'efficienza di amplificazione è comunemente indicata come En. Per comodità di analisi negli articoli successivi, ecco una breve introduzione ai fattori che influenzano l'efficienza di amplificazione.
| Fattori Influenti | Spiegazione | Sentenze |
| A. Inibitori della PCR | 1. L'RNA stampo può contenere sostanze che inibiscono la reazione PCR, come proteine o detergenti, tra gli altri. 2. Il cDNA ottenuto dopo la trascrizione inversa può contenere elevate concentrazioni di RNA stampo e componenti dei reagenti di trascrizione inversa, che potrebbero anche inibire la successiva PCR. | 1. La presenza di contaminazione può essere valutata misurando i rapporti A260/A280 e A260/A230 o eseguendo l'elettroforesi dell'RNA. 2. Dopo la trascrizione inversa, se il cDNA è diluito in una certa proporzione. |
| B. Progettazione irragionevole dell'innesco | Il primer non può ricotturare in modo efficace. | Controllare se nei primer sono presenti dimeri o strutture a forcina e se ci sono incongruenze; a volte è necessario prestare attenzione al design che abbraccia gli introni. |
| C. Procedura di reazione non idonea | 1. I primer non possono ricuocersi in modo efficace. 2. L'attività della DNA polimerasi non viene rilasciata completamente. 3. A causa delle alte temperature prolungate, l'attività della DNA polimerasi diminuisce. | 1. La temperatura di ricottura è superiore al valore Tm del primer. 2. Il tempo di pre-denaturazione è troppo breve. 3. La durata di ogni fase del protocollo di reazione è troppo lunga. |
| D. I reagenti non sono stati miscelati correttamente o errori di pipettaggio | Nel sistema di reazione, la concentrazione locale dei componenti della reazione PCR è troppo elevata o irregolare, con conseguente amplificazione non esponenziale della PCR. | / |
| E.Lunghezza dell'amplicone | La lunghezza dell'amplicone è troppo lunga, superando le 300 coppie di basi, con conseguente bassa efficienza di amplificazione. | Controllare se la lunghezza dell'amplicone è compresa tra 80 e 300 coppie di basi. |
| F. L'impatto dei reagenti qPCR | Una concentrazione inferiore di DNA polimerasi nei reagenti o concentrazioni ioniche subottimali nel tampone fanno sì che l'enzima Taq non raggiunga la sua massima attività. | La curva standard viene utilizzata per misurare l'efficienza di amplificazione dei primer. |
2. L'intervallo dei valori Ct
L'intervallo dei valori Ct è 15-35. Un valore Ct inferiore a 15 è considerato all'interno della fase di base e non ha raggiunto la soglia di fluorescenza. Idealmente, esiste una relazione lineare tra il valore Ct e il logaritmo del numero di copie iniziale del modello, noto come curva standard. Utilizzando la curva standard, quando l'efficienza di amplificazione è del 100%, il valore Ct per quantificare una singola copia del gene è calcolato essere circa 35. Se il valore Ct è maggiore di 35, teoricamente, il numero di copie iniziale del modello è inferiore a 1, il che può essere considerato statisticamente insignificante.
Per geni diversi, l'intervallo di valori Ct, dovuto alle variazioni nella quantità iniziale di copie del gene e nell'efficienza di amplificazione, richiede la creazione di una curva standard per quel gene per calcolare l'intervallo di rilevamento lineare del gene.
3.Fattori che influenzano i valori Ct
Come indicato dalla relazione tra il numero di cicli di amplificazione e la quantità di prodotto: Quantità di prodotto di amplificazione = Quantità di template iniziale × (1 + En)^numero di cicli, si può vedere che in condizioni ideali, la quantità di template iniziale e En avranno un impatto sul valore Ct. Le differenze nella qualità del template o nell'efficienza di amplificazione possono causare un valore Ct troppo alto o troppo basso.
4. Valori Ct troppo alti o troppo bassi
Xiao Yi ha consultato gli esperti del reparto tecnico della nostra azienda e ha riassunto le cause e le soluzioni per i due tipi comuni di problemi con i valori Ct per illuminare i nostri lettori.
| Problema | Cause | Soluzioni |
| Valore Ct troppo alto | La concentrazione del modello è bassa oppure sono presenti inibitori della PCR. L'efficienza di amplificazione è bassa. | 1. Aumentare la concentrazione del modello; oppure aumentare il rapporto di diluizione dell'RNA o del cDNA; oppure preparare nuovamente il modello. 2. Abbassare la temperatura di ricottura o utilizzare un metodo di amplificazione in due fasi; assicurarsi che i componenti e il sistema siano accuratamente miscelati; ottimizzare il protocollo di reazione oppure provare a sostituire i reagenti. |
| Valore Ct troppo basso | 1. Elevata concentrazione di template 2. Contaminazione in NTC (No Template Control) e NRC (No Reverse Control) 3. Progettazione inappropriata dell'innesco | 1. Ridurre la quantità di RNA stampo oppure diluire il cDNA a un rapporto più elevato. 2. Sostituire nuovamente tutti i reagenti oppure utilizzare reagenti anti-contaminazione UDGase. 3. Ottimizzare la procedura per evitare amplificazioni non specifiche. |
Questo conclude l'analisi delle cause anomale del valore Ct per questo problema. Successivamente, Xiao Yi consiglierà una gamma di prodotti convenienti per garantire che i tuoi dati sperimentali siano più accurati e affidabili. Vieni e scegli i tuoi preferiti!
| Nome del prodotto | Gatto# | Misurare |
| Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 11184ES08 | 5×1 ml |
| Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix per qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100 tonnellate |
| Hifair™ AdvanceFast Digestione RT-gDNA in un unico passaggio SuperMix per qPCR | 11151ES60 | 100 tonnellate |
| Kit di sintesi del cDNA Hifair™ AdvanceFast 1st Strand (senza colorante) | 11150ES60 | 100 tonnellate |