Un risultato rivoluzionario di Yeasen e la biotecnologia Molefuture
Con il rapido sviluppo della biotecnologia, la terapia mRNA, come metodo di trattamento emergente, ha attirato molta attenzione grazie alla sua forte programmabilità e alla rapida velocità di risposta. In campi come i vaccini mRNA e la terapia genica, la sintesi efficiente di mRNA di alta qualità è un passaggio cruciale per raggiungere gli obiettivi terapeutici. In questo processo, la T7 RNA polimerasi svolge un ruolo cruciale, poiché può catalizzare in modo efficiente la sintesi in vitro di mRNA.
Il problema del sottoprodotto dsRNA della RNA polimerasi T7
Sebbene la T7 RNA polimerasi svolga un ruolo importante nella sintesi di mRNA, l'operazione effettiva spesso si traduce nella produzione di RNA a doppio filamento (dsRNA) come sottoprodotto. La presenza di dsRNA non solo riduce la resa e la purezza di mRNA, ma può anche innescare risposte immunitarie non specifiche, influenzando efficacia e sicurezza. Pertanto, ridurre la produzione di dsRNA è diventata un'esigenza urgente nel settore. Attualmente, i metodi per ridurre il dsRNA includono principalmente l'ottimizzazione delle condizioni di reazione e l'uso di enzimi ausiliari. Sebbene questi metodi possano ridurre la produzione di dsRNA in una certa misura, spesso presentano problemi quali operazioni complesse e costi maggiori.
Perché dovremmo ricorrere all'ingegneria della RNA polimerasi T7?
Modificare direttamente la T7 RNA polimerasi per ridurre la produzione di dsRNA è una soluzione più fondamentale. Le tecniche di evoluzione enzimatica possono migliorare le sue proprietà catalitiche e aumentare la purezza e la resa dei prodotti modificando con precisione la sequenza o la struttura degli amminoacidi dell'enzima. Per la T7 RNA polimerasi, la modifica mirata può non solo ridurre la produzione di dsRNA, ma anche migliorare l'efficienza e la qualità complessive della sintesi di mRNA.
In qualità di fornitore di materie prime per la sintesi in vitro di mRNA, Yeasen Biotecnologia e la sua controllata Molefuture Biotecnologia, Avere ha sviluppato una nuova RNA polimerasi T7, utilizzando la piattaforma di evoluzione diretta ZymeEditor. Per ridurre al minimo la produzione di sottoprodotti come dsRNA durante i processi di trascrizione in vitro, il team di evoluzione ha progettato la RNA polimerasi T7 attraverso una combinazione di progettazione razionale e screening diretto.
Come si genera il dsRNA?
Secondo i resoconti della letteratura, la produzione del sottoprodotto dsRNA ha origine principalmente da due fonti (Figura 1): la prima è durante la transizione della T7 RNA polimerasi dalla conformazione di inizio alla conformazione di allungamento nelle prime fasi della trascrizione, il complesso ternario di trascrizione è incline alla dissociazione [1], con conseguente rilascio di un gran numero di catene di RNA corte (RNA abortivo) con lunghezze di circa 20 nt nel sistema. Queste catene di RNA agiscono come "primer", appaiamento complementare con lunghe catene di RNA e si estendono per produrre dsRNA sotto l'azione dell'attività RNA polimerasi RNA-dipendente della T7 RNA polimerasi (attività RDRP) [2,3]. La seconda fonte è innescata dall'attività di trasferimento di ribonucleotidi terminali posseduta dalla T7 RNA polimerasi. Quando la reazione di trascrizione raggiunge la fine del modello lineare, la T7 RNA polimerasi può aggiungere casualmente diversi ribonucleotidi senza dipendenza dal modello. Questi ribonucleotidi, formando "primer casuali", possono ripiegarsi inversamente e accoppiarsi in modo complementare con la regione mRNA bersaglio, estendendosi per produrre dsRNA. Il dsRNA prodotto tramite looping è chiamato dsRNA loopback [3,4]. Pertanto, al fine di ridurre i sottoprodotti del dsRNA, l'obiettivo della modifica della RNA polimerasi T7 risiede nella stabilizzazione del complesso ternario di trascrizione precoce o nell'indebolimento dell'attività di trasferimento terminale e della RNA polimerasi dipendente dall'RNA (RDRP) attività della RNA polimerasi T7.
Figura 1. Diagramma schematico della barriera energetica e del principio di formazione del dsRNA (dati non pubblicati)
Come superare barriera energetica della RNA polimerasi T7 transizione conformazionale?
Attraverso l'analisi strutturale e dell'energia libera, il team, da un lato, ha scoperto che insieme ai cambiamenti conformazionali della T7 RNA polimerasi, c'è anche un cambiamento di energia. L'energia libera della conformazione di allungamento è significativamente più alta di quella della conformazione di inizio, indicando che il processo di trascrizione deve superare una barriera energetica più elevata per produrre catene di mRNA complete. Una barriera energetica elevata è sfavorevole per una transizione conformazionale fluida. Pertanto, il team ha utilizzato razionale metodi di screening per identificare oltre 20 aminoacidi hotspot e costruire librerie di mutagenesi di saturazione corrispondenti.
Come modificare il trasferimento terminale e attività RDRP della RNA polimerasi T7
D'altro canto, considerando i report limitati sulle funzioni, i siti e i domini strutturali correlati al trasferimento terminale e alle attività RDRP della T7 RNA polimerasi, e poiché queste due attività, funzionalmente simili, probabilmente condividono siti chiave con la reazione principale della T7 RNA polimerasi, ovvero l'attività di trascrizione (ossia, l'attività di polimerizzazione dell'RNA dipendente dal DNA, DDRP), è difficile trovare amminoacidi hotspot per la modifica sito-diretta. Pertanto, il team ha costruito simultaneamente diverse librerie di mutazioni casuali basate su PCR soggetta a errori, combinate con la capacità di evoluzione ad alta produttività della piattaforma ZymeEditor, con conseguente diversità superiore a 10^6 per ogni singola libreria.
Scoperta basata sulla sonda dell'ideale T7 RNA polimerasi
Per bilanciare la produzione di RNA polimerasi T7 e monitorare il contenuto di dsRNA nella reazione di trascrizione in vitro, il team, con riferimento a modelli di trascrizione ottimizzati, ha progettato attentamente più modelli fluorescenti sonde che prendono di mira diverse regioni dei prodotti mRNA target. Queste sonde associano informazioni come resa di reazione, integrità e contenuto di dsRNA all'interno del sistema con segnali di fluorescenza. Maggiore è l'intensità di fluorescenza del sistema, più vantaggiosa è la prestazione del mutante. In teoria, questo metodo di screening può classificare i mutanti in base all'intensità di fluorescenza di diverse sonde, ottenendo mutanti della RNA polimerasi T7 con resa elevata o RNA abortivo ridotto, nonché mutanti con integrità migliorata o dsRNA loopback ridotto. Quando il modello di reazione viene sostituito con RNA, anche i mutanti con attività RDRP ridotta possono essere sottoposti a screening negativo, migliorando la selettività del modello della RNA polimerasi T7. Inoltre, aggiungendo nucleotidi modificati, analoghi di cap e aumentando la temperatura di reazione nel sistema di reazione a goccia, è possibile condurre un ulteriore screening per selezionare mutanti della RNA polimerasi T7 che tollerano substrati non naturali e mostrano una migliore stabilità termica.
Come effettuare lo screening al meglio T7 RNA polimerasi?
In base alle dimensioni delle biblioteche, il team hanno sviluppato processi di screening ad altissimo rendimento basati sulla selezione delle goccioline attivata dalla fluorescenza (FADS) e processi di screening ad alto rendimento basati sui metodi tradizionali delle micropiastre (MTPS).Attraverso più cicli di esperimenti, sono stati esaminati in totale oltre 10^7 mutanti, con conseguenti mutanti multipli con contenuto di dsRNA significativamente ridotto. Tra questi, alcuni mutanti hanno mostrato una diminuzione di dsRNA causata da RNA abortivo nella reazione, suggerendo che la conformazione di allungamento di questi mutanti della polimerasi è più stabile. Alcuni mutanti hanno mostrato una diminuzione del contenuto di dsRNA loopback nella reazione, indicando un indebolimento dell'attività di trasferimento terminale o attività RDRP in questi mutanti.
Dato che i vantaggi prestazionali dei mutanti sopra menzionati derivano da meccanismi diversi, il team ha costruito librerie di rimescolamento del DNA mirate a loro. Dopo lo screening, il team finalmente ottenuto mutanti con prestazioni superiori con una generazione di dsRNA estremamente bassa senza influenzare le rese e l'integrità dell'mRNA (Figura 2). Tuttavia, le rese di un mutante G47A+884G scoperto da Moderna sono state influenzate[5] (non pubblicato).
Figura 2. Processo di evoluzione degli enzimi e caratterizzazione delle prestazioni dei mutanti
(non pubblicato)
Analisi della generazione di dsRNA da parte T7 RNA polimerasi varianti?
Dopo l'analisi quantitativa, come mostrato nella Figura 3, utilizzando un modello di trascrizione da 9 kb in condizioni di capping della co-trascrizione, la RNA polimerasi T7 di tipo selvaggio ha prodotto circa 2,9 ng/μg di dsRNA quando si utilizzavano nucleotidi naturali, mentre un modello commerciale Enzima T7 ha prodotto circa 0,18 ng/μg di dsRNA. Tuttavia, la produzione di dsRNA di ciascuna variante della RNA polimerasi T7 costruito era inferiore a 0,10 ng/μg. In particolare, uno variante era solo 0,015 ng/μg, quasi 200 volte inferiore al tipo selvatico e 12 volte inferiore al tipo commerciale prodotto. Dopo ripetuti test, il vantaggio prestazionale delle varianti nella riduzione del dsRNA è stato costantemente osservato in diverse condizioni di reazione, indicando una buona compatibilità di sistema di questi mutanti e gettando le basi per un'ulteriore riduzione della produzione di dsRNA tramite tampone di reazione ottimizzazione. Inoltre, lo screening FADS ha anche ottenuto molteplici varianti con integrità del prodotto e stabilità termica migliorate, che possono soddisfare i requisiti di una gamma più ampia di applicazioni di trascrizione in vitro
Figura 3. Valutazione della generazione di dsRNA da parte delle varianti della RNA polimerasi T7 valutate utilizzando il kit Yeasen Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA e l'analisi dot blot dell'anticorpo J2.
Attualmente, diversi partner hanno già sperimentato le varianti dell'RNA polimerasi T7 e abbiamo ricevuto grandi elogi da parte loro. L'uso del nuovo enzima semplifica il processo di purificazione dell'mRNA, aumenta l'efficienza del lavoro e dimostra prestazioni eccezionali in molteplici scenari applicativi.
Informazioni su Molefuture Biotechnology
Molefuture Biotechnology è una sussidiaria di Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., specializzata nella fornitura di soluzioni personalizzate per la modifica degli enzimi basate sulla tecnologia di evoluzione degli enzimi.Sfruttare le risorse di Yeasen Biotecnologia, Molefuture opera su sei principali piattaforme tecnologiche: la piattaforma innovativa di evoluzione enzimatica ZymeEditor, una piattaforma di espressione multi-host ad alta efficienza, una piattaforma di sviluppo del processo di fermentazione, una piattaforma di sviluppo del processo di purificazione, una piattaforma di produzione di enzimi ultra-puliti e una piattaforma di analisi e controllo qualità degli enzimi. Con queste sei piattaforme tecnologiche, Molefuture può offrire un set completo di soluzioni personalizzate, tra cui evoluzione guidata dagli enzimi, sviluppo di nuovi enzimi, sviluppo di processi enzimatici e produzione su scala GMP per soddisfare le esigenze applicative degli enzimi in aree quali diagnostica in vitro, biomedicina, biologia sintetica, estetica medica, intermedi farmaceutici, et. al.
Informazioni per l'ordinazione
Di seguito sono riportati i prodotti rappresentativi offerti da Yeasen. Sono disponibili altre dimensioni. I nostri prodotti sono altamente ottimizzati per funzionare in concerto, per aiutare a garantire prestazioni e riproducibilità superiori. Possiamo anche fornire servizi personalizzati. Se sei interessato a un prodotto che non è mostrato, contattaci e lavoreremo con te per soddisfare le tue esigenze.
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