Stai cercando un modo affidabile per rilevare il dsRNA residuo durante la trascrizione in vitro dell'mRNA? Non cercare oltre il kit ELISA per l'RNA a doppio filamento (dsRNA). Tuttavia, con diversi kit commerciali disponibili, è importante notare che i dati di convalida potrebbero non essere sempre disponibili al pubblico, il che porta a incoerenza nel rilevamento del dsRNA. Ecco perché condividiamo il nostro report di convalida del kit ELISA per l'RNA a doppio filamento (dsRNA), che copre specificità, precisione, accuratezza, sensibilità e durata. Questo report funge da guida di riferimento per convalidare i metodi di rilevamento del dsRNA residuo su misura per condizioni sperimentali specifiche e standard farmacopeici normativi. Scopri di più sul nostro report di convalida per promuovere la standardizzazione del rilevamento del dsRNA.
ELISA a RNA a doppio filamento (dsRNA) EEsso
Sfondo:
Il kit ELISA per RNA a doppio filamento (dsRNA) è un kit di reagenti progettato per rilevare il dsRNA residuo prodotto durante il processo di trascrizione in vitro dell'mRNA. Utilizzando il principio sperimentale del saggio immunoenzimatico a sandwich con doppio anticorpo (ELISA) e il sistema di amplificazione biotina-streptavidina, questo kit offre un rilevamento sensibile del dsRNA residuo nei campioni.
I dati riassuntivi contengono parametri di convalida che coprono specificità, precisione, accuratezza, sensibilità e durata. Il report funge da guida di riferimento, esortando gli utenti a convalidare metodi di rilevamento dei residui di dsRNA adattati alle loro specifiche condizioni sperimentali e aderendo agli standard normativi della farmacopea.
Materiali e metodi:
Kit: Kit ELISA per RNA a doppio filamento (dsRNA): Cat#36717ES (YEASEN). Il kit include quattro tipi distinti di campioni standard dsRNA. Gli utenti hanno la possibilità di scegliere il tipo di campione standard che si allinea con il loro processo specifico per generare la curva standard, evitando così la necessità di preparare e testare tutti i campioni.
Metodi: I materiali e le fasi procedurali essenziali per l'esperimento sono specificati principalmente da Yeasen Biotechnology. Il kit è stato sottoposto a test e valutazioni approfonditi, assicurando che le sue prestazioni soddisfino i requisiti stabiliti da ICH Q2(R1) e dall'edizione 2020 della Farmacopea cinese Parte Quattro "9101 Analytical Method Validation Guidelines".
Risultati
- Linearità degli standard dsRNA
Questo rapporto ha sviluppato curve standard per tutti e quattro i tipi distinti di standard dsRNA, ciascuno con una lunghezza di 300 bp. Questi standard includono STD1, dsRNA non modificato; STD2, dsRNA modificato Pseudo-UTP; STD3, dsRNA modificato N1-Me-Pseudo-UTP; e STD4, dsRNA modificato 5-OMe-UTP. Ogni tipo di standard dsRNA mostra un'eccellente linearità di diluizione con R2 > 0,99 e un coefficiente di variazione (CV) della concentrazione misurata inferiore al 10% mostrato nelle Tabelle 1 e 5.
| Nome STD | Tipo UTP | Linearità della diluizione (R2＞(0,99) | Curriculum Vitae |
| Malattia di tipo 1 | UTP | 0.0156-1 pg/μL | ＜10% |
| Malattia di tipo 2 | pUTP | 0,0156-1 pg/μL | ＜10% |
| Livello 3 | N1-Me-pUTP | 0,0312-1 pg/μL | ＜10% |
| Malattia 4 | Cavo 5-OMe-UTP | 0,0625-1 pg/μL | ＜10% |
Tabella 1. Linearità dei diversi standard dsRNA.
| Concentrazione STD1N. (pg/μl) | Media misurata (pg/μl) | Recupero | Curriculum Vitae |
| 1 | 1.0001 | 100,0% | 3,1% |
| 0,5 | 0,4994 | 99,9% | 2,4% |
| 0,25 | 0,2516 | 100,7% | 3,3% |
| 0,125 | 0,1227 | 98,1% | 0,5% |
| 0,0625 | 0,0640 | 102,5% | 3,2% |
| 0,0312 | 0,0309 | 99,2% | 1,3% |
| 0,0156 | 0,0157 | 100,4% | 3,2% |
| 0 | / | / | / |
Tabella 2.Il recupero e il CV di STD1 diluito
| Concentrazione STD2N. (pg/μl) | Media misurata (pg/μl) | Recupero | Curriculum Vitae |
| 1 | 1.0001 | 100,0% | 0,7% |
| 0,5 | 0,4994 | 99,9% | 0,1% |
| 0,25 | 0,2514 | 100,6% | 0,9% |
| 0,125 | 0,1232 | 98,6% | 2,5% |
| 0,0625 | 0,0635 | 101,6% | 1,1% |
| 0,0312 | 0,0312 | 99,9% | 0,5% |
| 0,0156 | 0,0155 | 99,6% | 0,0% |
| 0 | / | / | / |
Tabella 3. Il recupero e il CV di STD2 diluito
| Conc. STD3 (pg/μl) | Media misurata (pg/μl) | Recupero | Curriculum Vitae |
| 2 | 2.0031 | 100,2% | 1.6% |
| 1 | 0,9880 | 98,8% | 2,4% |
| 0,5 | 0,5188 | 103,8% | 1,2% |
| 0,25 | 0,2383 | 95,3% | 2,2% |
| 0,125 | 0,1242 | 99,4% | 0,1% |
| 0,0625 | 0,0629 | 100,7% | 1,8% |
| 0,0312 | 0,0361 | 115,7% | 1,6% |
| 0 | / | / | / |
Tabella 4. Il recupero e il CV di STD3 diluito
| Conc. STD4 (pg/μl) | Media misurata (pg/μl) | Recupero | Curriculum Vitae |
| 4 | 4.0096 | 100,2% | 1,9% |
| 2 | 1.9940 | 99,7% | 0,7% |
| 1 | 0,9977 | 99,8% | 0,1% |
| 0,5 | 0,5108 | 102.2% | 0,1% |
| 0,25 | 0,2454 | 98,2% | 5,6% |
| 0,125 | 0,1207 | 96,5% | 2,8% |
| 0,0625 | 0,0624 | 99,9% | 0,3% |
| 0 | / | / | / |
Tabella 5. Il recupero e il CV di STD4 diluito
-
Specificità
- Analisi di specificità con dsRNA, ssRNA, dsDNA e ssDNA.
- La specificità non è stata influenzata dalla lunghezza dei dsRNA.
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UNprecisione
Aggiunta di 0,5 pg/μL di STD1 su un campione di mRNA noto con un contenuto di dsRNA di 0,36 pg/μL è stato condotto in tre diversi rapporti di volume (1:1, 1:20, 1:250). In tutti i casi, i tassi di recupero degli spike sono rientrati nell'intervallo 80-120%.
Il tasso di recupero degli spike viene calcolato come segue: Spike Recupero Tasso=(Misurato concentrazione Dopo picco×Totale volume Di appuntito campione−Misurato concentrazione Di IL campione×Totale volume Di IL campione)/(Teorico concentrazione Di IL picco×Volume Di IL picco)×100%
| Campioni | Rapporto di volume di STD1/campione | dsRNA misurato (pg/ml) | Arpione Recupero Valutare |
| Campione (TS) | / | 0,36 | / |
| TS+0,5 pg/μL Malattia di tipo 1 | 1:1 | 0,769 | 81% |
| TS+0,5 pg/μL Malattia di tipo 1 | 1:20 | 0,777 | 82% |
| TS+0,5 pg/μL Malattia di tipo 1 | 1：250 | 0.803 | 82% |
Tabella 6. Tasso di recupero dei picchi analisi
-
Precisione
- Precisione intra-test
Sono stati condotti esperimenti su tre livelli di concentrazione (alto, medio e basso) per ciascuno dei quattro campioni standard di dsRNA. All'interno di un singolo esperimento, ogni campione di concentrazione è stato sottoposto a otto test ripetuti. I risultati mostrano che il coefficiente di variazione (CV) è inferiore al 15% indicando una buona precisione intra-test.
| Malattia di tipo 1 | |||
| Teorico conc. (pg/ml) | Repliche | Media misurata (pg/μL) | Curriculum Vitae |
| 1 | 8 | 1.0002 | 3,11% |
| 0,125 | 8 | 0,1230 | 0,46% |
| 0,0156 | 8 | 0,0164 | 3,18% |
| Malattia di tipo 2 | |||
| Teorico conc. (pg/ml) | Repliche | Media misurata (pg/μL) | Curriculum Vitae |
| 1 | 8 | 1.0001 | 0,65% |
| 0,125 | 8 | 0,1231 | 2,46% |
| 0,0156 | 8 | 0,0162 | 0,02% |
| Livello 3 | |||
| Teorico conc. (pg/ml) | Repliche | Media misurata (pg/μL) | Curriculum Vitae |
| 2 | 8 | 2.0022 | 1,58% |
| 0,25 | 8 | 0,2444 | 2,17% |
| 0,0312 | 8 | 0,0328 | 1,64% |
| Malattia 4 | |||
| Teorico conc. (pg/ml) | Repliche | Media misurata (pg/μL) | Curriculum Vitae |
| 8 | 8 | 8.0803 | 0,27% |
| 1 | 8 | 0,9650 | 0,12% |
| 0,125 | 8 | 0,1322 | 2.76% |
Tabella 7. Analisi della precisione intra-test
- Precisione inter-test
Sono stati effettuati tre esperimenti utilizzando kit di 3 batch. In ogni esperimento, concentrazioni alte, medie e basse sono state scelte e testate tre volte per ciascuno dei quattro campioni standard di dsRNA, con otto repliche. Di conseguenza, sono stati acquisiti 24 punti dati a ogni livello di concentrazione, che sono stati poi utilizzati per l'analisi del coefficiente di variazione (CV). I risultati mostrano che il CV per ciascuna concentrazione degli standard era inferiore al 15%.
| Malattia di tipo 1 | |||
| Teorico conc. (pg/ml) | Test/repliche indipendenti | Media misurata (pg/μL) | Curriculum Vitae |
| 1 | 3/8 | 1.0007 | 2,38% |
| 0,125 | 3/8 | 0,1186 | 3,20% |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0173 | 1,27% |
| Malattia di tipo 2 | |||
| Teorico conc. (pg/ml) | Test/repliche indipendenti | Media misurata (pg/μL) | Curriculum Vitae |
| 1 | 3/8 | 0,9987 | 0,09% |
| 0,125 | 3/8 | 0,1269 | 1,06% |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0151 | 0,52% |
| Livello 3 | |||
| Teorico conc. (pg/ml) | Test/repliche indipendenti | Media misurata (pg/μL) | Curriculum Vitae |
| 2 | 3/8 | 2.0012 | 2,37% |
| 0,25 | 3/8 | 0,2415 | 0,14% |
| 0,0312 | 3/8 | 0,0330 | 1,81% |
| Malattia 4 | |||
| Teorico conc. (pg/ml) | Test/repliche indipendenti | Media misurata (pg/μL) | Curriculum Vitae |
| 8 | 3/8 | 7.9735 | 1,89% |
| 1 | 3/8 | 1.0225 | 0,13% |
| 0,125 | 3/8 | 0.1227 | 5,63% |
Tabella 8. Analisi della precisione inter-test
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Sensibilità
- LOD
Il limite di rilevamento del kit viene determinato aggiungendo il doppio della deviazione standard alla media dei valori dei vuoti. Misurando l'OD di 24 vuoti, calcolandone la media e la deviazione standard e quindi applicando questi valori alla curva adattata, il limite di rilevamento corrispondente si ottiene.
|
| OD |
| ||
| RNAds Standard | Media del vuoto | Deviazione standard di vuoto | Media del vuoto+2SD | LOD |
| Malattia di tipo 1 | 0,016 | 0,00048 | 0,01696 | ≤0,001 pg/μL |
| Malattia di tipo 2 | 0,016 | 0,00072 | 0,01744 | ≤0,001 pg/μL |
| Livello 3 | 0,034 | 0,00119 | 0,03638 | ≤0,001 pg/μL |
| Malattia 4 | 0,115 | 0,00290 | 0,1208 | ≤0,01 pg/μL |
Tabella 9. Analisi LOD
- Quantità di ordine
Il limite quantitativo del kit viene stabilito diluendo il punto di concentrazione più basso della curva standard a livelli ancora più bassi, garantendo un CV < 20% alla concentrazione più bassa, definendo così la soglia quantitativa. Il LOQ è il seguente.
| RNAds Standard | Quantità di ordine | Repliche | Valore CV(%) | Recupero (%) |
| Malattia di tipo 1 | 0,0156 pg/μl | 24 | <10% | 80~120% |
| Malattia di tipo 2 | 0,0312 pg/μl | 24 | <10% | 80~120% |
| Livello 3 | 0,0156 pg/μl | 24 | <10% | 80~120% |
| Malattia 4 | 0,125 pg/μl | 24 | <10% | 80~120% |
-
Ddurabilita'
- Anti-interferenza sui materiali IVT
Questo test mirato a valutare l'impatto di vari enzimi, tamponi, ecc., aggiunti al mRNA campione sul rilevamento dsRNA da parte del kit.
Aggiunta di concentrazioni specifiche di RNA polimerasi T7, inibitore di RNAsi, IPPA (pirofosfatasi inorganica), DNasi I, VCE (enzima di capping del vaccino), 2'-O-metiltransferasi (MT), tampone IVT 1× e citrato di sodio 1 mM a un campione di mRNA fornito e successivamente utilizzo di STD3 sia per la preparazione della curva standard che per il test del campione, ha consentito la valutazione della capacità del kit di rilevare il contenuto di dsRNA in questi campioni. I risultati dimostrano che la presenza di otto enzimi e tamponi diversi non ha influenzato la rilevazione accurata del dsRNA. Inoltre, i tassi di recupero osservati rientravano nell'intervallo dall'80% al 120%.
| Materiali IVT | RNAds Misurato (pg/μL) | Recupero |
| Nessuno | 0,6057 | 100% |
| T7 RNA polimerasi (15μg/mL) | 0,5411 | 89,32% |
| Inibitore della RNasi murina (27,5μg/mL) | 0,5142 | 84,88% |
| Pirofosfatasi inorganica (IPPA 10μg/mL) | 0,7132 | 117,7% |
| DNasi I (13,75μg/mL) | 0,6077 | 100,32% |
| Enzima di capping del vaccino (10μg/mL) | 0,6563 | 108,3% |
| 2´-O-metiltransferasi (10μg/mL) | 0,5776 | 95,4% |
| 1×tampone IVT | 0,5003 | 82,6% |
| 1 millimetro Citrato di sodio | 0,6251 | 103,2% |
Tabella 11. Il recupero di STD3 diluito aggiunto con materiali IVT
- Temperatura ddurabilita'
I kit sono stati conservati in entrambi 4°C e 37°C per rilevare le varianze di concentrazione dello standard dsRNA dopo 7 giorni. I risultati mostrano che le varianze sono tutte entro il 20%.
| RNAds Standard | RNAds Misurato (pg/μL) Giorno 0 | Le varianze dopo 7 giorni a 4°C |
| Malattia di tipo 1 | 1 | 10% |
| Malattia di tipo 2 | 1 | 5% |
| Livello 3 | 2 | 7% |
| Malattia 4 | 4 | 11% |
| RNAds Standard | RNAds Misurato (pg/μL) | Le varianze dopo 7 giorni a 37°C |
| Malattia di tipo 1 | 1 | 18% |
| Malattia di tipo 2 | 1 | 4% |
| Livello 3 | 2 | 5% |
| Malattia 4 | 4 | 8% |
Tabella 12. Analisi della durabilità della temperatura
Prodotto correlato:
| Nome del prodotto | Codice Prodotto | Specifiche |
| Kit ELISA RNA a doppio filamento (dsRNA) | 36717ES | 48T/96T |
| CleaScrip™ T7 RNA Polimerasi (RNA a basso ds, 250 U/μL) | 10628ES | 10/100 KU |
| T7 RNA polimerasi Grado GMP (250 U/μL) | 10625ES | 10/100 KU |
Letture correlate:
Il kit ELISA a RNA a doppio filamento (dsRNA) è stato utilizzato per convalidare i mutanti della RNA polimerasi T7 a basso dsRNA, insieme al metodo di dot blotting dell'anticorpo J2.
Riferimenti:
- ICH, 2022: convalida del metodo analitico Q2, versione provvisoria.
- NMPA, 2007: Principi generali per la valutazione della convalida del metodo analitico per l'analisi del controllo di qualità dei prodotti biologici
- Commissione per la farmacopea cinese (ChPC), 2020: Farmacopea cinese, Parte quarta: Linee guida per la convalida dei metodi di analisi quantitativa per campioni biologici