Negli ultimi anni, i farmaci basati sull'mRNA hanno suscitato notevole attenzione e attirato l'attenzione della ricerca. T7 RNAP è noto per la sua semplicità e capacità di catalizzare la sintesi di RNA con elevata resa e fedeltà in vitro. Tuttavia, durante il processo di trascrizione, T7 RNAP può produrre sottoprodotti quali RNA corti abortivi, RNA prematuramente terminati e RNA 3'-estesi, che creano condizioni favorevoli per la formazione di dsRNA. Pertanto, ridurre la produzione di dsRNA è diventata un'esigenza urgente nelle applicazioni pratiche.
Di recente, uno studio pionieristico intitolato "FADS e il design semi-razionale hanno modificato la RNA polimerasi T7 riducendo la produzione di dsRNA, con attività di transferasi terminale inferiore e RDRP" è stato pubblicato online da Yeasen e dal Molefuture Team. I ricercatori hanno progettato con successo T7 RNAP per ridurre significativamente la produzione di sottoprodotti dsRNA durante la trascrizione, riducendola all'1,8% dell'enzima di tipo selvatico attraverso una combinazione di evoluzione diretta e progettazione semi-razionale.
Screening basato su FADS di T7 RNAP
Per lo screening di T7 RNAP, è stato scelto FADS (Fluorescence-activated droplet sorting) per soddisfare i requisiti di elevata produttività dell'evoluzione proteica. Per prevenire la frammentazione prematura delle cellule, i ricercatori hanno utilizzato un chip PDMS con doppie fasi acquose, in cui il lisozima è stato miscelato con le cellule sul chip ed esercitato la sua attività all'interno delle goccioline Figura 1I ricercatori hanno generato diverse librerie mutanti casuali con una diversità che va da 105 a106Dopo lo screening, sono state identificate 10 varianti dominanti e designate come Mut1 a Mut10. Come mostrato in Figura 2E E Figura 2F, il contenuto di dsRNA di Mut1, Mut7 e Mut9 era significativamente inferiore a quello del tipo selvatico
Figura 1. Panoramica dei FADS
Figura 2. Screening casuale delle librerie e valutazione delle varianti
Progettazione semi-razionale di T7 RNAP
Ricercatori ha condotto un'esplorazione di progettazione semi-razionale, ha creato dieci librerie sature a sito singolo e ha utilizzato il tradizionale metodo a doppia sonda basato su piastra microtiter per lo screening (Figura 3). La sonda aggiunta all'estremità 5' viene utilizzata per il rilevamento della resa di RNA.
Figura 3. Progettazione semi-razionale guidata dalla struttura per dsRNA ridotto
Dopo aver esaminato oltre 1000 mutanti, i ricercatori ha identificato sei candidati: Mut11 (K180E), Mut12 (S228F), Mut13 (G238L), Mut14 (A70Q), Mut15 (A383H) e Mut16 (I743L). La resa totale di RNA di tutti e sei i mutanti non differiva significativamente dal tipo selvatico, indicando un'efficienza di trascrizione complessiva comparabile. Come previsto, il contenuto di dsRNA di Mut11 e Mut14 era significativamente inferiore rispetto al tipo selvatico(Figura 4).
Figura 4. Screening della piastra microtiter e valutazione delle varianti
Mut17 dal rimescolamento del DNA produce meno dsRNA
Per ottimizzare ulteriormente il T7 RNAP, sono state selezionate quattro varianti con basso contenuto di dsRNA, ma che soddisfacevano al contempo i requisiti di produzione.I ricercatori hanno quindi costruito una libreria di DNA shuffling e, dopo averla esaminata con piastre di microtitolazione, hanno identificato una variante che mostrava una produzione di dsRNA inferiore rispetto al suo RNAP T7 parentale, denominato Mut17 (A70Q/F162S/K180E). Hanno quindi analizzato i prodotti trascrizionali di Mut17 e delle sue varianti parentali (Mut14, Mut11 e Mut7). Come mostrato in Figura 5, tutte e quattro le varianti hanno mostrato significative riduzioni nella produzione di dsRNA durante la trascrizione rispetto al tipo selvatico. Sorprendentemente, Mut17 ha mostrato un contenuto di dsRNA significativamente inferiore di solo l'1,80% e di appena 0,007 ng/μg nel sistema solvente di screening.
Figura 5. Contenuto di dsRNA di Mut17 e delle sue mutazioni parentali
L'immunogenicità del prodotto IVT del mutante è significativamente inferiore a quella del tipo selvatico.
Prossimo, Abbiamo valutato l'immunogenicità dei prodotti IVT nell'AR murinaW264.7 cellule. Come mostrato nelle Figure 2A e 2B, i livelli di mRNA e proteine dell'IFN-β sono stati ridotti nell'ARW264.7 cellule transfettate con mRNA prodotto da mutanti rispetto a quelle di tipo selvatico, indicando che l'mRNA sintetizzato dal T7 RNAP di tipo selvatico ha suscitato la risposta immunitaria più forte, mentre l'mRNA dei mutanti ha mostrato una risposta significativamente ridotta. Nello specifico, l'mRNA IFN-β delle cellule trattate con Mut11 RNA era solo il 9,7% delle cellule trattate di tipo selvatico e la sua proteina era 12,93 pg/mL. Inoltre, l'espressione di EGFP non ha mostrato differenze significative in quantità o qualità tra gli mRNA generati da diversi T7 RNAP (Figura 6C), soddisfacendo i requisiti per le applicazioni industriali.
Figura 6. Risposta IFN-β ed espressione EGFP nelle cellule dei mammiferi
Le attività RDRP e transferasi terminale del mutante sono molto più basseNoir rispetto a quelli del tipo selvatico.
Per studiare l'impatto delle mutazioni sulla riduzione del dsRNA, i ricercatori condotti studi in silico su tutte queste mutazioni. Il risultato suggerisce una chiara indicazione di ridotta attività RDRP nelle varianti, poiché mostrano una tendenza ridotta a utilizzare l'RNA come stampo. Analogamente, ciò potrebbe aver avuto un impatto sull'attività della transferasi terminale di T7 RNAP. Come mostrato in Figura 7, a diverse concentrazioni, tutte e 4 le varianti hanno mostrato meno del 50% del valore di fluorescenza rispetto al tipo selvatico.
Successivamente, è stato impiegato un test di eterogeneità dell'estremità 3' per caratterizzare l'attività di trasferimento terminale di T7 RNAP. Concentrandosi sulla proporzione di RNA con n>0, che riflette l'attività di transferasi terminale, i ricercatori hanno scoperto che questi RNA rappresentavano l'82,94% nel tipo selvatico, mentre i mutanti mostravano le seguenti percentuali: Mut11 (70,29%), Mut7 (67,88%), Mut14 (63,31%) e Mut17 (55,62%) (Figura 8)È importante notare che queste percentuali sono altamente coerenti con l'abbondanza di dsRNA nei prodotti (Figura 5)Questi risultati indicano una significativa riduzione dell'attività della transferasi terminale dei mutanti, che, insieme alla diminuzione dell'attività RDRP, contribuisce alla diminuzione del dsRNA.In particolare, l'attività della transferasi terminale potrebbe svolgere un ruolo più cruciale, come evidenziato dal più basso accumulo di n>0 RNA osservato in Mut17, che presenta anche la più bassa produzione di dsRNA. (Figura 5 e Figura 8).
Figura 7. Attività RDRP relativa
Figura 8Eterogeneità nell'estremità 3' dei prodotti di RNA
Conclusione
Questo studio fornisce una metodologia solida per identificare mutanti con contenuto di dsRNA ridotto e isola con successo più mutanti dsRNA che hanno ridotto l'attività della RNA polimerasi RNA-dipendente e della transferasi terminale. Rafforza sostanzialmente la convalida della sicurezza e dell'efficacia integrali alle terapie mRNA, sottolineandone le profonde implicazioni per l'avanzamento dei vaccini mRNA e delle applicazioni di terapia genica.
Allo stesso tempo, la società madre Yeasen ha anche lanciato un prodotto T7 RNAP che riduce significativamente il dsRNA contenuto. Diversi partner hanno già testato i mutanti T7 RNAP modificati sviluppati da Molefuture e il prodotto è stato ampiamente riconosciuto dai clienti. I nostri clienti ritengono che l'uso del nuovo enzima semplifichi il processo di purificazione dell'mRNA e riduce notevolmente l'immunogenicità dell'IVT prodotti, dimostrano prestazioni eccezionali in molteplici scenari applicativi, dimostrando il loro ampio potenziale applicativo nel campo biofarmaceutico!
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