Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha mostrato prospettive di applicazione clinica e di ricerca scientifica estremamente ampie in campi quali il rilevamento di agenti patogeni, il rilevamento di mutazioni tumorali e la genetica riproduttiva, grazie alla sua elevata sensibilità di rilevamento, alla forte specificità e alla capacità di eseguire rilevamenti sia qualitativi che quantitativi. La costruzione della libreria, fase fondamentale dell'NGS, influisce direttamente sulla qualità del sequenziamento. Sulla base delle linee guida di revisione della registrazione per i prodotti diagnostici in vitro (IVD), è necessario fornire dati di ricerca sulle principali materie prime. Un'analisi e una verifica complete dovrebbero essere eseguite combinando fattori quali le informazioni di base, gli indicatori dei parametri e le fonti di approvvigionamento delle materie prime per determinare la fonte più adatta di materie prime. Il processo convenzionale di costruzione di librerie di DNA e RNA comprende principalmente passaggi chiave come la sintesi del cDNA, la frammentazione del DNA, la legatura dell'adattatore e l'amplificazione della libreria, I vari passaggi contengono molti tipi di enzimi di materie prime. Lo screening degli enzimi di materie prime allunga il ciclo di ricerca. Su questa base, i prodotti modulari per la costruzione di biblioteche semplici e convenienti sono diventati la nuova scelta per lo sviluppo di prodotti IVD.
Figura 1. Processo di costruzione della libreria di DNA convenzionale (sinistra) e processo di costruzione della libreria di RNA (destra), prendendo come esempio la piattaforma Illumina
La sintesi della trascrizione inversa è la parte fondamentale di RNA-Seq, Nuovo tipo di alto trascrittasi inversa ad alta efficienza, che integra molteplici funzioni quali elevata sensibilità, elevata prodotto del cDNA e la compatibilità con modelli di strutture complesse rappresentano un punto caldo della ricerca. La piattaforma di modifica enzimatica ZymeEditor™ di Yeasen ha ottenuto un prodotto di trascrizione inversa completo con prestazioni notevolmente migliorate attraverso la modifica direzionale di M-MLV. Può essere utilizzato in molteplici scenari applicativi, quali RNA-seq, sequenziamento di singole cellule, clonazione di cDNA e costruzione di librerie.
Figura 2. Prestazioni di 13488ES applicate in RNA-seq
A causa della breve lunghezza di lettura della piattaforma di sequenziamento, il DNA deve essere frammentato in modo casuale prima della costruzione della libreria. Nella fase iniziale, la frammentazione enzimatica era scoraggiante a causa di problemi di uniformità e distorsioni. Biotecnologia Yeasen ha sviluppato due enzimi di frammentazione unici, Un enzima di frammentazione ad azione vigorosa che funziona a 37℃ per 3-30 minuti e un enzima di frammentazione ad azione moderata che funziona a 30℃ per 10-40 minuti. I prodotti di frammentazione enzimatica basati sulla frammentazione casuale stanno gradualmente migliorando i loro difetti, Vengono combinati in prodotti modulari per la frammentazione del DNA, la riparazione delle estremità e l'A-tailing, che soddisfano le numerose esigenze di diversi campioni e diversi tipi di sequenziamento.
Figura 3. Effetti di frammentazione di diversi enzimi di frammentazione del DNA: enzima di frammentazione ad azione vigorosa (sinistra) ed enzima di frammentazione ad azione moderata (destra)
Il tasso di conversione della biblioteca è un indicatore importante per valutare la qualità della biblioteca. Un tasso di conversione elevato significa in una certa misura una maggiore ricchezza della biblioteca e una migliore uniformità dei dati di sequenziamento. La DNA ligasi T4 convenzionale si concentra sull'ottimizzazione della legatura ad alta efficienza, ma i frammenti sono inclini all'autolegatura, il che riduce il tasso di conversione della libreria e influisce sulla ricchezza della libreria e sulla qualità del sequenziamento. La piattaforma di ingegneria enzimatica Yeasen ZymeEditor™ esegue modifiche direzionali sulla T4 DNA Ligase per ottenere un nuovo mutante, In combinazione con un tampone di legatura attentamente ottimizzato, è stato sviluppato un prodotto con modulo di legatura con elevata stabilità termica e un basso tasso di autolegatura dei frammenti, che migliora significativamente il tasso di conversione della libreria.
Figura 4. Stabilità termica e analisi dei residui del linker 12996ES
Gli enzimi di amplificazione PCR sono tutti necessari nei metodi di preparazione delle librerie NGS. La maggior parte delle DNA polimerasi ad alta fedeltà hanno attività polimerasica 5'→3' e attività esonucleasica 3'→5', Può sintetizzare il DNA nella direzione 5'→3' correggendo le basi erroneamente incorporate, In questo modo è possibile amplificare rapidamente e con elevata fedeltà i frammenti di DNA. Ma pochi enzimi sono specificamente progettati per NGS, Non sono molti i prodotti di amplificazione delle librerie che siano efficienti, accurati, specifici e in grado di amplificare target di diverse dimensioni e contenuti di GC senza distorsioni e, allo stesso tempo, di avere la capacità di premiscelare in anticipo i primer. Yeasen Biotechnology ha sviluppato una DNA polimerasi ad alta precisione con un design esclusivo e una premiscela PCR hot start ottimizzata. È specificamente progettata per un'amplificazione efficiente, ad alta fedeltà e a basso bias delle librerie NGS, affrontando le sfide dell'amplificazione complessa delle librerie NGS.
Figura 5. Analisi del tasso di errore di stabilità e amplificazione di 12980ES
Oltre alla serie di prodotti di moduli di costruzione di librerie NGS sopra menzionati, Forniamo anche prodotti enzimatici grezzi one-stop, per soddisfare le esigenze combinate di diversi clienti. I prodotti delle materie prime per la costruzione di librerie NGS di Yeasen sono sottoposti a rigorosi standard di controllo qualità in fabbrica, a rigorosi controlli di qualità sulle prestazioni dei lotti e sulla stabilità, così puoi costruire librerie senza preoccupazioni.
| Categoria di prodotto | Nome del prodotto | N. di cat. | Osservazione |
| Sintesi efficiente del cDNA | Alta qualità™ Trascrittasi ultra inversa (200 U/μL) | 14604ES | Enzima di trascrizione inversa |
| Sistema NGS™ Hieff Kit di sintesi ds-cDNA | 13488ES | Modulo di sintesi del cDNA | |
| Il DNA Frammentazione e riparazione finale e A-tailing | Materiale Smerasi | 12907ES | Frammentazione del DNA |
| 12619ES | Il DNA Modulo di frammentazione e riparazione finale e A-tailing | ||
| Riparazione e A-Tailing | Modulo di riparazione rapida delle estremità/dA-Tailing Hieff NGS® | 12608ES | Modulo di riparazione finale e A-tailing |
| Legatura dell'adattatore | 10299ES | Ligasi del DNA T4 | |
| Amplificazione della libreria | 2× Ultima HF Mix di amplificazione | 13344ES | Enzima ad alta fedeltà |