Guida completa alla coltivazione organoide

— Un articolo completo per approfondire la tua conoscenza degli organoidi.

Introduzione agli organoidi

Gli organoidi sono strutture tridimensionali con funzioni fisiologiche che imitano lo stato normale (o patologico) di organi o tessuti interni, ottenuto tramite coltivazione 3D all'esterno del corpo. In termini più semplici, gli organoidi sono colture cellulari tridimensionali in cui le cellule staminali vengono coltivate in un gel di matrice. Sotto l'influenza di inibitori/attivatori chimici, citochine e additivi di coltura, gli organoidi si sviluppano in strutture tissutali simili agli organi corrispondenti.

Caratteristiche degli organoidi

Gli organoidi possiedono capacità di auto-rinnovamento, mantenendo la struttura fisiologica e la funzione del tessuto di origine. Sono spesso definiti "microorgani in una capsula di Petri". Utilizzando le capacità di auto-rinnovamento, differenziazione e auto-organizzazione delle cellule staminali, gli organoidi possono essere crioconservati per l'uso nelle biobanche e possono subire un'espansione illimitata. Gli organoidi sono altamente complessi e, rispetto alle cellule 2D, assomigliano più da vicino allo stato in vivo.

Figura 1. Coltura organoide di cellule di adenocarcinoma del colon umano [1]

Applicazioni degli organoidi

La caratteristica distintiva degli organoidi è la loro capacità di simulare meglio l'ambiente in vivo, rendendoli adatti per analisi di biologia molecolare e cellulare. Colmando il divario tra i livelli animale e cellulare, gli organoidi offrono una soluzione superiore per la ricerca in aree quali studi sui tumori, screening di farmaci, medicina rigenerativa e altro ancora. Sono stati ampiamente applicati nell'induzione funzionale dei tessuti, nella creazione di modelli di malattia, nello screening di farmaci, nei test antinfiammatori, nella ricerca clinica e in vari altri aspetti della ricerca, mostrando un grande potenziale sia nella ricerca di base che nelle applicazioni traslazionali.

Con la continua evoluzione dei sistemi di coltivazione degli organoidi e delle tecniche sperimentali, gli organoidi sono stati utilizzati per vari tessuti e organi, tra cui l'intestino (intestino tenue/colon), lo stomaco, il fegato, il cuore, i polmoni, la prostata, il pancreas, i reni, i seni, le strutture simili al cervello, la retina, l'orecchio interno e altro ancora.

Gli organoidi derivati ​​da cellule staminali tumorali hanno mostrato un potenziale significativo nella comprensione dei meccanismi di insorgenza e sviluppo dei tumori, nello screening della sensibilità ai farmaci e nella promozione della medicina di precisione e della diagnosi personalizzata. Numerosi articoli di Cell and Science indicano che gli organoidi mostrano elevata sensibilità e specificità nel predire l'efficacia dei farmaci antitumorali. Di recente, gli organoidi tumorali hanno dimostrato il loro ruolo nel predire le risposte dei pazienti ai farmaci antitumorali e nell'aiutare nella formulazione di piani di trattamento personalizzati.

Ricerca sui meccanismi di sviluppo: le capacità di differenziazione degli organoidi li rendono adatti allo studio dei processi e dei meccanismi dello sviluppo embrionale. I processi di induzione regolati da percorsi di segnalazione come Wnt e BMP possono essere utilizzati per studiare lo sviluppo di organi come il cervello, il pancreas e lo stomaco [2][3][4].

Creazione di modelli di danno da malattia: gli organoidi indotti da tessuti o organi specifici possono essere utilizzati per studiare modelli di malattie specifiche. I team guidati da Zhao Bing e Lin Xinhua hanno utilizzato modelli di infezione da organoidi umani per studiare i meccanismi molecolari dell'infezione da SARS-CoV-2 e del danno epatico, fornendo strumenti cruciali per la ricerca sui meccanismi patogeni del virus e il successivo sviluppo di farmaci [5]. Il gruppo di ricerca guidato da Deng Hongkui presso la School of Life Sciences dell'Università di Pechino ha utilizzato piccole molecole e citochine per stimolare la costruzione di un nuovo organoide intestinale con caratteristiche di rigenerazione del danno: l'iperorganoide.Questo organoide può essere trasmesso e amplificato per un periodo prolungato, mantenendo il genoma e promuovendo la riparazione del danno tissutale del colon, alleviando i sintomi patologici in un modello animale di colite acuta e altro ancora [6].

Medicina rigenerativa: gli organoidi derivati ​​dalle cellule staminali possono riparare o sostituire tessuti danneggiati o malati per ripristinare la normale funzione tissutale. Hanno ampie applicazioni nella terapia cellulare, anche per altre malattie neurodegenerative, diabete, malattie cardiovascolari, disturbi della retina, lesioni del midollo spinale e altro ancora. Come nuovo trattamento nel campo della medicina rigenerativa, DA01, utilizzando piccole molecole come SB-431542, LDN193189, CHIR-99021, Y-27632 e la proteina Sonic Hedgehog (Shh), stimola le cellule staminali pluripotenti a differenziarsi in neuroni dopaminergici. Questi neuroni vengono quindi trapiantati nelle aree danneggiate del cervello dei pazienti con malattia di Parkinson in fase avanzata, fornendo una nuova direzione e un nuovo approccio per il trattamento della malattia [7].

Test di tossicità ed efficacia dei farmaci: gli organoidi possono essere utilizzati per verificare la farmacotossicità di nuovi farmaci in organi o tessuti specifici, fornendo supporto di dati per lo sviluppo di nuovi farmaci. L'uso di organoidi renali di Hyman per verificare la tossicità renale del cisplatino è un esempio [8].

Screening dei farmaci: gli organoidi derivati ​​dalle cellule staminali possono essere utilizzati per test in vitro delle reazioni ai farmaci, fornendo supporto teorico allo screening dei farmaci. Gli organoidi del colon possono essere utilizzati per studiare i piani di terapia farmacologica per pazienti con mutazioni CFTR e gli organoidi tumorali possono essere utilizzati per valutare situazioni di terapia farmacologica individualizzate per i pazienti [9].

Storia dello sviluppo degli organoidi

Fonti di organoidi

Gli organoidi normali hanno origine principalmente da cellule staminali, tra cui cellule staminali pluripotenti (PSC) e cellule staminali adulte (ASC). Le cellule staminali pluripotenti includono cellule staminali embrionali (ESC) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Rispetto alle cellule staminali pluripotenti, le cellule staminali adulte hanno il vantaggio di essere più semplici e veloci da modellare, ma lo svantaggio di costruire strutture organoidi relativamente più semplici. Le strutture organoidi costruite da cellule staminali pluripotenti sono più complesse.

Prodotti utilizzati in Coltivazione di organoidi

Piccole molecole comunemente utilizzate nella coltura di organoidi (riassunto): super pratiche, non dimenticare di aggiungerle ai preferiti!

❶ Y-27632 (Cat#53006ES, Cat#52604ES): Un potente inibitore di Rock, che inibisce competitivamente p160ROCK (Ki=140 nM) e ROCK-II (IC50=800 nM) mediante competizione con l'ATP.Inibisce anche PRK2 (IC50=600 nM). Solitamente aggiunto durante la prima semina nella coltura su piastra; i successivi cambi di terreno potrebbero non richiedere aggiunta. Il trattamento delle cellule staminali embrionali umane con Y-27632 (10 µM) per 1 h può inibire l'apoptosi, aumentare l'efficienza del clone ed estendere i passaggi cellulari.

Concentrazione di lavoro consigliata: 10 μM

❷ SB-202190 (Cat#53005ES): un efficiente inibitore della chinasi p38 MAPK, che ha come target p38α/β. SB202190 può indurre la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane in cellule muscolari cardiache, promuovere l'auto-rinnovamento delle cellule staminali neurali ed è applicabile alla coltura di organoidi gastrointestinali e mammari.

Concentrazione di dissoluzione consigliata: sciogliere 10 mg in 3,018 mL di DMSO per ottenere una soluzione 10 mM; conservare a -20℃.

Concentrazione di lavoro consigliata: 10 μM

❸ CHIR-99021 (Cat#53003ES): un derivato dell'amminopirimidina, che agisce come inibitore di GSK-3 (GSK3α/β). Induce la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane nell'endoderma ed è utilizzato nelle colture di organoidi renali e retinici. CHIR-99021, se utilizzato in combinazione con altri reagenti, stimola la riprogrammazione delle cellule somatiche in cellule staminali.

Concentrazione di dissoluzione consigliata: sciogliere 5 mg in 3,58 mL di DMSO per ottenere una soluzione 3 mM; conservare a -20℃.

Concentrazione di lavoro consigliata: 3 μM

❹ A 83-01 (Cat#53002ES): un inibitore del pathway Activin/NODAL/TGF-β, che inibisce l'attività della chinasi ALK5/4/7. Generalmente utilizzato nella coltura di organoidi di fegato, prostata e ghiandola mammaria. È comunemente utilizzato per inibire la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e mantenere l'auto-rinnovamento delle cellule in vitro.

Concentrazione di dissoluzione consigliata: sciogliere 5 mg in 5,93 mL di DMSO per ottenere una soluzione 2 mM; conservare a -20℃. (Nota: questo prodotto è instabile in soluzione e si consiglia l'uso immediato dopo la preparazione.)

Concentrazione di lavoro consigliata: 2 μM

❺ Gastrina I (Cat#53007ES): la gastrina è un ormone peptidico gastrointestinale endogeno che stimola le cellule della parete gastrica a secernere acido gastrico. È fondamentale per gli studi sugli organoidi gastrointestinali. Quando si coltivano organoidi intestinali ed epatici, l'aggiunta di gastrina aiuta a prolungare il tempo di sopravvivenza degli organoidi.

Concentrazione di dissoluzione consigliata: sciogliere 1 mg in 2,38 mL di soluzione di ammoniaca all'1% per ottenere una soluzione 0,2 mM; conservare a -20℃.

Concentrazione di lavoro consigliata: 10 nM

❻ Nicotinamide (Cat#51402ES): la nicotinamide, una vitamina B3, partecipa a varie reazioni redox enzimatiche ed è utilizzata nella coltura di organoidi gastrointestinali, epatici e mammari. La nicotinamide, in combinazione con citochine e altri reagenti biochimici, mostra proprietà antinfiammatorie, promuove la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali in cellule produttrici di insulina, inibisce l'attività delle sirtuine ed è utilizzata per promuovere la formazione di organoidi e prolungare la durata di vita degli organoidi.

Concentrazione di dissoluzione consigliata: sciogliere 100 mg in 8,19 mL di H2O (o DMSO) per ottenere una soluzione 100 mM; conservare a -20℃.

Concentrazione di lavoro consigliata: 10 mM

❼ Forskolin (Cat#51001ES): Forskolin può attivare l'adenilato ciclasi, comunemente usata per aumentare i livelli intracellulari di cAMP. Forskolin induce la differenziazione di vari tipi di cellule, attiva PXR e FXR e ha effetti antiaggreganti piastrinici e antipertensivi. Quando si coltivano organoidi epatici, è essenziale aggiungere questa sostanza.

Concentrazione di lavoro consigliata: 1-10 μM

❽ Prostaglandina E2 (Cat#60810ES): la prostaglandina E2 (PGE2) regola molti sistemi fisiologici, mediando la proliferazione e la differenziazione cellulare.È necessario durante la coltura di organoidi epatici e prostatici ed è associato al rilassamento della muscolatura liscia, all'infiammazione, alla riproduzione, alla regolazione del ciclo del sonno e all'integrità della mucosa gastrica.

Concentrazione di dissoluzione consigliata: sciogliere 1 mg in 0,28 mL di DMSO per ottenere una soluzione 10 mM; conservare a -20℃.

Concentrazione di lavoro consigliata: 500 nM

❾ N-acetil-L-cisteina (Cat#50303ES): la N-acetil-L-cisteina (NAC) è un precursore del glutatione antiossidante, con effetti antiossidanti e inibitori delle ROS. Inibisce l'apoptosi delle cellule neuronali ed è richiesta nel processo di coltura della maggior parte degli organoidi.

Concentrazione di dissoluzione consigliata: sciogliere 2 g in 24,51 mL di H2O (o DMSO) per ottenere una soluzione di 500 mM; conservare a -20℃.

Concentrazione di lavoro consigliata: 1 mM

Informazioni sul prodotto correlate

Riferimenti:

[1] Sato T, Stange DE, et al.Espansione a lungo termine di organoidi epiteliali provenienti da colon umano, adenoma, adenocarcinoma ed epitelio di Barrett. Gastroenterologia. 2011 novembre;141(5):1762-72. doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050. Epub 2011 settembre 2. PMID: 21889923.

[2] Lancaster MA, Renner M, et al. Gli organoidi cerebrali modellano lo sviluppo del cervello umano e la microcefalia. Nature. 2013.501(7467):373-379. http://dx.doi.org/10.1038/nature12517.

[3] Greggio C, et al. Nicchie artificiali tridimensionali decostruiscono lo sviluppo del pancreas in vitro. Sviluppo. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.

[4] McCracken KW, et al. Modellazione dello sviluppo umano e delle malattie in organoidi gastrici derivati ​​da cellule staminali pluripotenti. Nature. 2014.516(7531):400-404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.

[5] Zhao B, Ni C, et al. Riepilogo dell'infezione da SARS-CoV-2 e del danno ai colangiociti con organoidi duttali del fegato umano. Protein Cell. 2020 ottobre;11(10):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704.

[6] Qu M, Xiong L, et al. Creazione di colture di organoidi intestinali che modellano la rigenerazione epiteliale associata a lesioni. Cell Res. 2021 marzo;31(3):259-271. doi: 10.1038/s41422-020-00453-x. Epub 2021 8 gennaio. PMID: 33420425; PMCID: PMC8027647.

[7] BlueRock Therapeutics annuncia il primo paziente trattato con DA01 nello studio di fase 1 su pazienti con malattia di Parkinson avanzata. Comunicato stampa di BlueRock Therapeutics: 8 giugno 2021.

[8] Takasato M, Er PX, et al. Gli organoidi renali da cellule iPS umane contengono molteplici lignaggi e modellano la nefrogenesi umana. Nature. 2015.526(7574):564-568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.

[9] Spence JR, Mayhew CN, et al. Differenziazione diretta di cellule staminali pluripotenti umane nel tessuto intestinale in vitro. Natura. 2011.470(7332):105-109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.