Capo^™ Cellula veloce diretta Il kit RT-qPCR basato sul colorante SYBR Green è adatto per l'estrazione di RNA da tutti i tipi di cellule animali (come cellule della parete del lignaggio cellulare e cellule in sospensione, cellule di coltura primaria, varie cellule staminali, cellule iPS, ecc.), senza la necessità di estrarre RNA, e può essere utilizzato direttamente per l'analisi dell'espressione qPCR, che è breve, facile da usare e ha un basso tasso di errore. Ci vogliono solo 1,5 ore per completare i passaggi dalla preparazione del modello alla reazione di trascrizione inversa e all'analisi dell'espressione genica.

Il kit include reagenti per la trascrizione inversa e per il rilevamento della fluorescenza, che possono essere utilizzati per l'analisi dell'espressione genica senza dover acquistare reagenti aggiuntivi.

Specifiche

Componenti

Magazzinaggio

Il tampone di lisi FCD e il tampone di lavaggio FCD sono stati sciolti e conservati a 4°C per evitare contaminazioni. La soluzione di arresto FCD, la DNasi I, la miscela RT FCD 4× Hifair™, la miscela master qPCR SYBR 2× Hieff™ FCD devono essere conservate a una temperatura compresa tra -25 e -15℃.

Istruzioni

1. Preparazione dei prodotti di scissione

1)1. Sciogliere il reagente a temperatura ambiente, capovolgerlo e mescolarlo delicatamente prima dell'uso, quindi utilizzarlo dopo una leggera centrifugazione per evitare la formazione di schiuma*.

*La mancata miscelazione dei reagenti, l'uso di un oscillatore per la miscelazione e la mancata configurazione dei reagenti sul ghiaccio possono portare a una riduzione delle prestazioni della reazione.

2) A seconda del tipo di cellula**, trasferire le cellule in una provetta da centrifuga e centrifugare a 5000 rpm per 2 min per raccogliere le cellule e aspirare bene il terreno di coltura. Se le cellule sono coltivate in piastre da 96 pozzetti, il terreno di coltura può essere aspirato direttamente.

​​​​​​​3) Aggiungere 150 μL di tampone di lavaggio FCD in ciascun pozzetto, lavare le cellule soffiando, centrifugare a 5000 giri/min per 2 minuti e aspirare il tampone di lavaggio FCD***.

​​​​​​​4) Aggiungere 48 μL di soluzione tampone di lisi FCD e 2 μL di soluzione DNasi Ⅰ a ciascun pozzetto, soffiare e mescolare a temperatura ambiente, quindi lasciare riposare per 5 minuti, quindi aggiungere 2.5 μL di soluzione di arresto FCD dopo l'incubazione****, quindi soffiare e mescolare per circa 5 volte per ottenere il prodotto di scissione*****.

** Il requisito di base per il numero di celle è 1 × 10⁴ cellule per pozzetto e questo kit può essere utilizzato nell'intervallo di 1 × 10³ - 1 × 10⁶ cellule. Se il numero di cellule è maggiore, la quantità di soluzione tampone di lisi FCD e di soluzione di DNasiⅠ può essere aumentata proporzionalmente, come appropriato.

*** Le condizioni di centrifugazione variano da cella a cella, quindi centrifugare a una velocità adatta alle celle utilizzate.

**** Aggiungere 2,5 μL di soluzione bloccante FCD a 50 μL di lisato e aumentare la quantità di soluzione bloccante FCD secondo necessità.

***** Per la conservazione a lungo termine delle soluzioni dei prodotti di lisi cellulare, conservare a -20°C.

5) Sciogliere 4 x Hifair™ FCD RT Mix a temperatura ambiente e mescolare con leggera inversione, posizionare sul ghiaccio e configurare il sistema di reazione secondo la tabella seguente:

*******Il livello di utilizzo consigliato è 2-5 μL, cercare di non superare il 45%.

1. Trascrizione inversa

Pipettare e mescolare delicatamente la soluzione di reazione preparata sopra ed eseguire la reazione di trascrizione inversa secondo la procedura riportata nella tabella seguente:

* La temperatura di trascrizione inversa consigliata è di 55°C. Per modelli ad alto contenuto di GC o modelli complessi, la temperatura di trascrizione inversa può essere aumentata a 60°C. Il prodotto di trascrizione inversa può essere utilizzato direttamente per il rilevamento RT-qPCR a valle. Per evitare l'inibizione della reazione qPCR da parte del sistema di trascrizione inversa e per ottenere il valore Ct appropriato (10-35), il prodotto può essere diluito 10-1000 volte e quindi utilizzato. Se gli esperimenti a valle non vengono eseguiti per un breve periodo, può essere conservato a -20℃.

1. PCR quantitativa a fluorescenza

1) Reazione sistema configurazione

Per la preparazione della soluzione di reazione (preparazione su ghiaccio) si raccomandano i seguenti rapporti.

*Non aggiungere più di 1/10 del volume RT-qPCR del prodotto di trascrizione inversa. Un'elevata concentrazione di stampo porterà facilmente a un'amplificazione non specifica, diluizione appropriata di 5-50 volte. La quantità di stampo consigliata è 4 μL, cercare di non superare i 6 μL. Quando le prestazioni della reazione sono scarse, la concentrazione del primer può essere regolata nell'intervallo di 0,2-1,0 μmol/L.

2) Procedura di amplificazione PCR quantitativa a fluorescenza (metodo in due fasi)

3）Procedura di amplificazione rapida per PCR quantitativa fluorescente (metodo in due fasi)

* La temperatura di annealing/estensione e il tempo di estensione finale possono essere regolati in modo appropriato in base ai requisiti sperimentali. Il programma rapido è adatto per la maggior parte dei geni e il programma standard può essere provato per singoli geni complessi di struttura secondaria.

Appunti

1. Questo prodotto è destinato esclusivamente alla ricerca.
2. Per la vostra sicurezza, operate indossando camici da laboratorio e guanti monouso.

Versione EN20230908

Documenti:

Manuali

11172-Hieff™ Fast Cell Direct. EN20230908.pdf