Il kit Hieff Superfast DNA Methylation Bisulfite (basato su colonna) converte rapidamente le citosine non metilate nei campioni di DNA in uracile, lasciando invariate le citosine metilate. Durante il trattamento con bisolfito ad alta temperatura, il DNA a doppio filamento si denatura in filamenti singoli. In presenza di HSO3-, i residui di citosina subiscono una deaminazione e vengono convertiti in uracile, con le citosine metilate che rimangono inalterate. Nella successiva amplificazione PCR, l'uracile viene sostituito dalla timina (T). Il processo di conversione richiede solo 5 minuti, accogliendo un input di DNA che va da 100 pg a 2 μg e raggiunge un'efficienza di conversione ≥99% per le citosine non metilate. Il DNA convertito è adatto per applicazioni downstream come l'amplificazione PCR e il sequenziamento NGS.

Caratteristica

Basso input: Adatto per convertire campioni che vanno da 100 pg a 2 μg

Breve tempo di conversione: circa 5 minuti.

Danni minimi al campione: Mantenimento di una buona integrità del campione dopo la conversione.

Elevata efficienza di conversione: Tasso di conversione ≥99%, alti tassi di conversione nelle regioni ad alto GC con un basso tasso di falsi positivi.

Adatto per campioni rari, come la conversione della metilazione del DNA di singole cellule.

In grado di convertire i campioni di RNA tramite metilazione.

Prodotto Componenti

Nota:

Per 10 test per scatola: aggiungere 4,4 mL di etanolo anidro alla soluzione di lavaggio.

Per 50 test per scatola: aggiungere 22 mL di etanolo anidro alla soluzione di lavaggio.

Dopo aver aggiunto l'etanolo anidro, capovolgere e mescolare bene, quindi conservare per un uso futuro. Assicurarsi che il tappo della bottiglia sia ben chiuso per evitare l'evaporazione dell'etanolo, che potrebbe influire sulle prestazioni del reagente.

Figura

Figura 4. La conversione del bisolfito su campioni di DNA genomico umano è stata eseguita utilizzando sia il kit di conversione 12225 che quello del competitor Q. Successivamente, sono stati utilizzati kit di preparazione di librerie di DNA a singolo filamento specifici per la metilazione per generare librerie. I dati sulla resa delle librerie e sul controllo di qualità sono presentati sopra. I risultati dimostrano che quando si sequenziano le librerie raggruppate sia dal kit 12225 che dal kit Q del competitor, il kit 12225 ha prodotto un output di dati più elevato, ha raggiunto un rapporto on-target (%) più elevato e ha mostrato tassi di duplicazione (%) più bassi.

Spedizione e stoccaggio

Conservare la soluzione di conversione 12225-A a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Conservare gli altri componenti a temperatura ambiente. La durata di conservazione è di 12 mesi.

Nota:

1. Per garantire il successo degli esperimenti downstream, quantificare accuratamente la quantità totale di DNA in ingresso durante la fase di conversione. Si consiglia di utilizzare Qubit 3.0/4.0 per la quantificazione del DNA, con un rapporto A260/A280 compreso tra 1,7 e 1,9. L'intervallo di DNA in ingresso dovrebbe essere compreso tra 100 pg e 2 μg, con un intervallo ottimale compreso tra 100 ng e 1 μg. Un input di DNA insufficiente può ostacolare il rilevamento downstream, mentre un input eccessivo può ridurre l'efficienza di recupero e conversione.

2. La soluzione di conversione, la soluzione di desolfonazione e la soluzione di lavaggio contengono componenti volatili. Dopo l'uso, serrare subito i tappi e conservare a temperatura ambiente.

3. Per i campioni post-conversione, procedere con gli esperimenti a valle tempestivamente. Per la conservazione a breve termine, conservare a -20°C e per la conservazione a lungo termine, conservare a -80°C.

4. Per la vostra sicurezza e salute, indossate un camice da laboratorio e guanti monouso durante il funzionamento.

5. Questo prodotto è destinato esclusivamente alla ricerca!

Istruzioni

Preparazione dei reagenti e dei materiali di consumo: Provetta da centrifuga sterile da 1,5 ml, acqua priva di enzimi, etanolo assoluto, provetta per PCR;

l Conversione del bisolfito:

1) Preparare la provetta PCR sterile corrispondente in base al numero di campioni da testare e preparare il sistema di reazione secondo la seguente tabella:

2) Sistema di trasformazione

Utilizzare una pipetta per soffiare e miscelare il sistema sopra descritto oppure agitarlo e miscelarlo per 5 secondi, quindi centrifugarlo per un breve periodo e centrifugare la soluzione di reazione sul fondo della provetta per PCR.

la Nota: 1. In questo momento, il volume totale della soluzione di reazione nella provetta PCR è di 200 μL. Per rendere la trasformazione più completa, la soluzione di reazione deve essere divisa in parti uguali e trasferita in una nuova provetta PCR sterile dopo aver soffiato e miscelato nel passaggio 2), e la procedura di trasformazione deve essere eseguita. Dopo la conversione, le soluzioni di reazione nelle due provette PCR sono state combinate nella stessa colonna di purificazione per la purificazione.

2. Se il volume del campione è compreso tra 20 e 40 μL, ridurre il volume della soluzione di trasformazione per mantenere un volume totale di 200 μL.

3. Se il volume del campione è 50 μL, vengono aggiunti 150 μL della soluzione di trasformazione, il volume totale viene mantenuto a 200 μL e il tempo di trasformazione viene esteso a 6-10 min.

3) Impostazione del programma di conversione CT

La provetta PCR viene posizionata su uno strumento PCR dotato di un programma preimpostato per eseguire la reazione.

l Purificazione

1) Ttrasferire 200 μL di conversione soluzione al Pcolonna di deflussoS, centrifugare per 30-60 s 13000 G, scartare il filtrato e mettere la colonna di purificazione nel Ctubo di raccoltaS Ancora;

2) Aggiungere 100 μL di Tampone di lavaggio in Colonne di purificazione (confermare che è stato aggiunto etanolo assoluto), centrifugare per 30-60 s 13000 G, scartare il filtrato e mettere la colonna di purificazione nel Ctubo di raccoltaS Ancora;

3) Aggiungere 200 μL di Tampone di desolfonazione dentro il Colonne di purificazione , e lasciare riposare la reazione a temperatura ambiente per 20 min. Dopo la reazione, centrifugare per 30-60 s 13000 G, scartare il filtrato e posizionare il Colonne di purificazione nel Ctubo di raccoltaS Ancora;

4) Aggiungere 200 μL di Tampone di lavaggio al Colonne di purificazione, centrifugare per 30-60 s 13000 G scartare il filtrato e posizionare il Pcolonna di deflussoS nel Ctubo di raccoltaS Ancora;

5) Ripetere il passaggio 4) una volta;

6) Trasferisci il Colonne di purificazione alla provetta da centrifuga da 1,5 mL preparata, aggiungere 10-30 μL di Tampone di eluizione al centro della membrana del filtro dopo aver aperto il coperchio e averlo asciugato, e raccogliere il Il DNA dopo aver lasciato riposare per 1 minuto a temperatura ambiente e centrifugato per 1 minuto a 13000 G;

7) Conservare il Il DNA temporaneamente a -20 ℃. Per la conservazione a lungo termine, conservare il Il DNA a -80 ℃ ed evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti non necessari.

Nota: il prodotto di trasformazione purificato può essere utilizzato direttamente nella successiva reazione PCR o nel processo di sequenziamento.

Manuale