Kit di preparazione congiunta della libreria DNA&RNA Hieff NGS® Versione 2 è un kit di co-libreria DNA&RNA per la piattaforma di sequenziamento Illumina®&MGI®, che contiene un reagente efficiente per la sintesi di cDNA e un reagente per la digestione enzimatica. Rispetto alla libreria tradizionale costruzione metodo, questo prodotto può completare in modo efficiente la sintesi del cDNA e la libreria DNA&RNA costruzione in una provetta. Il kit contiene enzimi di alta qualità per la frammentazione del DNA e combina la frammentazione del DNA, la riparazione delle estremità e il dA-tailing in un unico passaggio, riducendo significativamente i tempi e i costi di preparazione della libreria. Questo kit di preparazione della libreria ha un'eccellente velocità di conversione della libreria ed è applicabile a campioni di tutti gli animali, piante, microrganismi, ecc. comuni, e anche ai campioni FFPE. Questo kit aggiornato che utilizza la più recente ligasi ottimizzata riduce notevolmente la velocità di autolegatura durante la legatura dell'adattatore. Inoltre, l'introduzione di una nuova polimerasi ad alta fedeltà migliora ulteriormente l'omogeneità e la fedeltà dell'amplificazione.

Tutti i componenti forniti nel kit sono stati sottoposti a rigorosi controlli di qualità e verifiche funzionali, il che garantisce al massimo la stabilità e la ripetibilità della costruzione della libreria.

Specifiche

Componenti

Nota: * indica che questo reagente non è incluso nel kit e sono necessari reagenti aggiuntivi. Il kit È compatibile con le doppie piattaforme di Illumina^®&MGI^®, ma miscela di primer aggiuntiva (CAT # 13334 Miscela di primer per MGI^® e Cat# 13335 Primer Mix per Illumina^®) è obbligatorio.

Flusso di lavoro:

Magazzinaggio

Questo prodotto deve essere conservato a -25~-15℃ per 1 anno.

Appunti

Informazioni sull'operazione

1. 1. Per la vostra sicurezza, utilizzate camici da laboratorio e guanti monouso.
2. Scongelare i componenti a temperatura ambiente.Dopo lo scongelamento, mescolare accuratamente con il vortex, far girare brevemente la provetta e riporla nel ghiaccio per un uso successivo.
3. Si raccomanda di eseguire ogni fase di reazione in un termociclatore con coperchio riscaldato. Il termociclatore deve essere preriscaldato alla temperatura impostata prima dell'uso.
4. Si prega di utilizzare materiali di consumo senza RNasicontaminazione e pulizia dell'area sperimentale regolarmente. RNAZap di ThermoFisher^TM è stato raccomandato l'uso di uno spray ad alta efficienza per la rimozione degli acidi nucleici, per eliminare la contaminazione da RNasi.
5. Operazioni improprie possono molto probabilmente causare contaminazioni da aerosol, influenzando l'accuratezza del risultato.Si raccomanda l'isolamento fisico obbligatorio delle regioni di miscelazione della reazione PCR e delle regioni di analisi della purificazione del prodotto PCR. Dotato di attrezzature quali pipette specializzate per la costruzione di librerie.
6. 6. Questo prodotto è destinato esclusivamente alla ricerca.

Legatura dell'adattatore

1. I kit Illumina o MGI Long Adapter (Barcoded Adapter) e short Adapter sono disponibili tra cui i clienti possono scegliere in base alle proprie esigenze sperimentali.
2. Si raccomanda di selezionare adattatori commerciali di alta qualità. Se si selezionano adattatori fatti in casa, si prega di affidarsi a un'azienda con esperienza nella sintesi di primer NGS e di sottolineare la necessità di un rigoroso controllo della contaminazione. Inoltre, si raccomanda di preparare la soluzione di annealing del DNA in un banco pulito e di utilizzare un solo tipo di adattatore alla volta per evitare la contaminazione incrociata.
3. Si prega di scongelare gli adattatori sul ghiaccio o a 4°C; quando si utilizza a temperatura ambiente, la temperatura del laboratorio non deve superare i 25°C per evitare che gli adattatori si denaturano.
4. La concentrazione dell'adattatore influisce direttamente sull'efficienza della legatura e sulla resa della libreria. Il volume dell'adattatore aggiunto al kit è fissato a 5 μl. Si consiglia di diluire gli adattatori con tampone 0,1×TE e gli adattatori diluiti possono essere conservati a 4°C per 48 ore. Tabella1 elenca la quantità di adattatore consigliata per diverse quantità di RNA in input.

Tabella 1-1 Illumina consigliata^® quantità adattatore per input diversi DNA e RNA

Tabella 1-2 Il MGI consigliato^® quantità adattatore per input diversi DNA e RNA

*L'utilizzo dell'adattatore può essere regolato in base ai diversi tipi di campioni di RNA totale e alla quantità di input.

Amplificazione della libreria

I numeri dei cicli di amplificazione devono essere rigorosamente controllati. Un'amplificazione insufficiente può portare a una bassa resa della libreria; una sovra-amplificazione può introdurre un aumento di bias, errori, letture duplicate e prodotti chimerici. Tabella 2 elenca i numeri di cicli consigliati per ottenere una resa della libreria di 1 μg.

Tavolo 2 Il numero di cicli consigliato per generare la libreria DNA&RNA *

Nota: *La resa della libreria non è solo correlata alla quantità di input e al numero di cicli di amplificazione, ma è anche influenzata dalla qualità dei campioni, dalle condizioni di frammentazione e dalle condizioni di ordinamento. Nel processo di costruzione della libreria, scegliere le condizioni più appropriate in base alla situazione effettiva.

Pulizia del DNA basata su microsfere e selezione delle dimensioni

1. 1.Ci sono diversi passaggi nel processo di costruzione della libreria che richiedono perle magnetiche per la purificazione del DNA. Consigliamo le perle di selezione del DNA Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) o le perle magnetiche AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) per la purificazione del DNA e la selezione delle dimensioni.
2. 2. Le sfere magnetiche devono essere portate a temperatura ambiente prima dell'uso, altrimenti la resa diminuirà e l'effetto di selezione delle dimensioni sarà compromesso.
3. 3. Le sfere magnetiche devono essere mescolate bene tramite vortex o pipettaggio prima dell'uso.
4. 4. Non aspirare le microsfere durante il trasferimento del surnatante, anche tracce di microsfere potrebbero influire sulle reazioni successive.
5. 5. L'etanolo all'80% deve essere preparato fresco, altrimenti l'efficienza del recupero ne risentirà.
6. 6. Le perle magnetiche devono essere asciugate a temperatura ambiente prima di eluire il prodotto. Una secchezza insufficiente causerà facilmente l'influenza dei residui di etanolo sulle reazioni successive; una secchezza eccessiva causerà la rottura delle perle magnetiche e ridurrà la resa di purificazione. Normalmente, l'essiccazione a temperatura ambiente per 3-5 minuti è sufficiente per consentire alle perle di asciugarsi completamente.
7. 7.Se necessario, i campioni di DNA purificati o selezionati in base alle dimensioni vengono eluiti in1× Il tampone TE può essere conservato a 4°C per 1-2 settimane o a -20°C per un mese.

Analisi della qualità della biblioteca

1. La qualità delle librerie costruite viene generalmente analizzata misurando le concentrazioni e le distribuzioni dimensionali.
2. Le concentrazioni delle librerie possono essere misurate mediante metodi basati sulla fluorescenza come Qubit e PicoGreen o qPCR.
3. NON è consigliato l'uso di metodi di quantificazione basati sull'assorbanza come NanoDrop.
4. Si raccomanda di utilizzare il metodo qPCR per la quantificazione delle librerie: i metodi basati sulla fluorescenza come Qubit e PicoGreen non possono differenziare le strutture dsDNA incomplete (inserti senza adattatore o con solo una delle estremità legata con adattatore) dalle librerie complete. Il metodo qPCR amplificherà e misurerà solo le librerie complete con entrambe le estremità legate con adattatori (le librerie sequenziabili), fornendo così una misurazione più accurata per il caricamento.
5. La distribuzione dimensionale delle librerie può essere analizzata utilizzando Agilent Bioanalyzer o altri dispositivi basati sui principi dell'elettroforesi capillare o della microfluidica.

Altri materiali

1. 1. Perle magnetiche per la purificazione del DNA: perle di selezione del DNA Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) o AMPure^®Perline XP (A63880) o altri prodotti equivalenti.

2.Adattatori: adattatore completo per Illumina (Yeasen Cat#13519-13520 o altri prodotti equivalenti) o adattatore completo per MGI (Yeasen Cat#13360-13362 o altri prodotti equivalenti).

3. Analisi della qualità della libreria: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip o altri prodotti equivalenti; reagenti quantitativi della libreria.
4. Altri materiali: etanolo assoluto, acqua ultrapura sterile, punte per pipette a bassa ritenzione, provetta per PCR, supporti magnetici, termociclatore, ecc.

Documenti:

Manuali

12305ES-Kit di preparazione della libreria DNA&RNA NGS® Hieff V2.pdf