Sistema NGS™ Hieff One Pot Flash DNA Library PrepKit è un kit rapido per librerie di DNA enzimatiche,strega contiene enzimi di alta qualità per la frammentazione del DNA e combina la frammentazione del DNA, la riparazione delle estremità e il dA-tailing in un unico passaggio, riducendo significativamente i tempi e i costi di preparazione della libreria.

Questo kit di preparazione della libreria è compatibile con campioni da 100 pg-500 ng di tutti gli animali, piante, microrganismi, ecc. più comuni.

e realizzare rapidamente la frammentazione del DNA, la riparazione dei terminali e la reazione di aggiunta della coda A in un unico tubo. Il kit deve essere abbinato ad adattatori e primer ed è compatibile con Illumina e MGI piattaforme di sequenziamento ad alto rendimento.

Caratteristica

1) Adatto per campioni di DNA genomico da 100 pg a 500 ng.

2）compatibile con Illumina e MGI piattaforme di sequenziamento ad alto rendimento.

3）Frammentazione, riparazione delle estremità e A-tailing reazione all'interno Durata: 5 minuti

4）Efficiente tasso di conversione della libreria ed efficienza di amplificazione.

Specifiche

Componenti

Nota: * indica che questo reagente non è incluso nel kit e sono necessari reagenti aggiuntivi.Il kit È compatibile con le doppie piattaforme di Illumina e MGI, ma miscela di primer aggiuntiva (CAT # 13334 Miscela di primer per MGI e Cat# 13335 Primer Mix per Illumina).

Magazzinaggio

Questo prodotto deve essere conservato a -25~-15℃ per 1 anno.

Cifre

Figura 1. Rilevamento del DNA di 10 tipi di microrganismi

Le librerie sono state preparate utilizzando Gatto#12316 protocollo ,10 ng dello standard del DNA della comunità microbica ZymoBIOMICS (Zymo Research® #D6306). Le librerie sono state raggruppate e sequenziate su un Illumina (SE75).I dati di sequenziamento sono stati omogeneizzati a 20M e confrontati tra la composizione prevista e quella rilevata per entrambi i livelli di input. Il rilevamento di gDNA microbico specifico era coerente con la composizione prevista. Composizione prevista: Cryptococcus neoformans 2%, Saccharomyces cerevisiae 2%, Bacillus subtilis 12%, Escherichia coli 12%, Enterococcus faecalis 12%, Lactobacillus fermentum 12%, Listeria monocytogenes 12%, Pseudomonas aeruginosa 12%, Staphylococcus aureus 12% e Salmonella enterica 12%.

Informazioni sull'operazione

1. Si prega di operare con camici da laboratorio e guanti monouso,per la tua sicurezza.

2. Scongelare i componenti a temperatura ambiente. Dopo lo scongelamento, mescolare accuratamente mediante vortex, centrifugare brevemente la provetta e riporla nel ghiaccio per un uso successivo.

3.Quando si prepara la soluzione di reazione in ogni fase, si consiglia di utilizzare una pipetta per soffiare e mescolare uniformemente o agitare delicatamente. Un'agitazione violenta può causare una diminuzione dell'output della libreria.

4. Per evitare la contaminazione incrociata dei campioni, si consiglia di utilizzare una testa della pistola con un elemento filtrante. Si prega di sostituire la testa della pistola quando si assorbono campioni diversi.

5. Si raccomanda di eseguire ogni fase di reazione in un termociclatore con coperchio riscaldato. Il termociclatore deve essere preriscaldato alla temperatura impostata prima dell'uso.

6. Operazioni improprie possono molto probabilmente causare contaminazioni da aerosol, influenzando l'accuratezza del risultato. Si raccomanda l'isolamento fisico obbligatorio delle regioni di miscelazione della reazione PCR e delle regioni di analisi della purificazione del prodotto PCR. Dotato di apparecchiature quali pipette specializzate per la costruzione di librerie.

7. Questo prodotto è destinato esclusivamente alla ricerca.

Informazioni sulla frammentazione del DNA

1. La gamma compatibile di questo kit è 100 pg–500 ng di DNA di input. Dovrebbe essere utilizzato il più possibile DNA di input di alta qualità con A260/A280 = 1,8-2,0.

2. Se il DNA di input contiene un'elevata concentrazione di agente chelante di ioni metallici o altri sali, ciò potrebbe influenzare gli esperimenti successivi. Si consiglia di diluire il DNA in ddH2O o Tebuffer (10 mm tris-HCl, pH 8,0-8,5; 0,1 mM EDTA).

3. Per la maggior parte del DNA genomico di alta qualità, il tempo di digestione è mostrato nella Tabella 1. Il kit ha una bassa preferenza e può tollerare vari modelli con contenuto di GC.

Tabella 1. Tempo consigliato per la frammentazione convenzionale del DNA genomico

Legatura dell'adattatore

1. La concentrazione dell'adattatore influisce direttamente sull'efficienza della legatura e sulla resa della libreria. L'uso eccessivo dell'adattatore può produrre più dimero adattatore; un basso dosaggio può influire sulla legatura efficienza e rendimento della libreria. Le tabelle 2 e 3 elencano la quantità consigliata di adattatore per diversi input di DNA utilizzando questo kit.

Tabella 2. L'Illumina consigliata quantità di adattatore per diversi input di DNA

Tabella 3. Il MGI consigliato quantità di adattatore per diversi input di DNA

Amplificazione della libreria

I numeri dei cicli di amplificazione devono essere rigorosamente controllati. Un'amplificazione insufficiente può portare a una bassa resa della libreria; una sovra-amplificazione può introdurre un aumento di bias, errori, letture duplicate e prodotti chimerici. Tabella 4 elenca i numeri di ciclo consigliati che mirano alla resa della biblioteca di 1 ioG.

Tabella 4. I cicli consigliati di 100 pg-500 ng di DNA in ingresso

Pulizia del DNA basata su microsfere e selezione delle dimensioni

1. Ci sono diversi passaggi nel processo di costruzione della libreria che richiedono perle magnetiche di purificazione del DNA. Consigliamo Hieff NGS™ Perle di selezione del DNA (Yeasen Cat#12601) o AMPure™ Perle magnetiche XP (Beckman Cat#A63880) per la purificazione del DNA e la selezione delle dimensioni.

2. Le sfere magnetiche devono essere portate a temperatura ambiente prima dell'uso, altrimenti la resa diminuirà e l'effetto di selezione delle dimensioni sarà compromesso.

3. Prima dell'uso, le sfere magnetiche devono essere mescolate bene tramite vortex o pipettaggio.

4. Non aspirare le microsfere durante il trasferimento del surnatante, anche tracce di microsfere potrebbero influire sulle reazioni successive.

5. L'etanolo all'80% deve essere preparato fresco, altrimenti l'efficienza del recupero ne risentirà.

6. Le perle magnetiche devono essere asciugate a temperatura ambiente prima di eluire il prodotto. Una secchezza insufficiente causerà facilmente l'alterazione delle reazioni successive da parte dei residui di etanolo; una secchezza eccessiva causerà la rottura delle perle magnetiche e ridurrà la resa di purificazione. Normalmente, l'essiccazione a temperatura ambiente per 3-5 minuti è sufficiente per consentire alle perle di asciugarsi completamente.

7. Se necessario, i campioni di DNA purificati o selezionati in base alle dimensioni vengono eluiti in 0,1× Il tampone TE può essere conservato a 4°C per 1-2 settimane o a -20°C per un mese.

Analisi della qualità della biblioteca

1. La qualità delle librerie costruite viene generalmente analizzata misurando le concentrazioni e le distribuzioni dimensionali.

2. Le concentrazioni delle librerie possono essere misurate mediante metodi basati sulla fluorescenza come Qubit e PicoGreen o qPCR.

3. Non è consigliabile utilizzare metodi di quantificazione basati sull'assorbanza come NanoDrop.

4. Si raccomanda di utilizzare il metodo qPCR per la quantificazione delle librerie: i metodi basati sulla fluorescenza come Qubit e PicoGreen non possono differenziare le strutture dsDNA incomplete (inserti senza adattatore o con solo una delle estremità legata con adattatore) dalle librerie complete. Il metodo qPCR amplificherà e misurerà solo le librerie complete con entrambe le estremità legate con adattatori (le librerie sequenziabili), fornendo così una misurazione più accurata per il caricamento.

5. La distribuzione dimensionale delle librerie può essere analizzata utilizzando Agilent Bioanalyzer o altri dispositivi basati sui principi dell'elettroforesi capillare o della microfluidica.

Documenti:

Scheda di sicurezza

12316_Scheda di sicurezza_HB250211_IT.PDF

Manuali

12316_Manuale_Ver.EN20241225.pdf