Descrizione del prodotto

Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit è un kit di microsfere magnetiche appositamente per la purificazione di mRNA. Le microsfere mRNA Capture sono microsfere paramagnetiche di dimensioni micrometriche accoppiate con code Oligo dT (poli A), che possono essere utilizzate per isolare mRNA da 10 ng a 4 μg di RNA completo legandosi a mRNA con code poli A.

Specifiche

Componenti

Magazzinaggio

Il prodotto deve essere conservato a una temperatura compresa tra 2 e 8 °C per un anno, evitando il congelamento.

Istruzioni

1. Materiali richiesti non inclusi

Rack magnetico, provette PCR prive di nucleasi

2. Operazione

1) Equilibrare le perle di cattura dell'mRNA a temperatura ambiente (~ 30 min).

2) Diluire 10 ng – 4 μg di RNA totale a 50 μL con acqua priva di nucleasi in una provetta per PCR priva di nucleasi e posizionarla sul ghiaccio.

3) Mescolare le sfere magnetiche capovolgendole o agitandole nel vortex. Aggiungere 50 μL di sfere magnetiche in 50 μL di campione di RNA totale e pipettare 6 volte per mescolare bene. Centrifugare brevemente fino al fondo della provetta.

4) Incubare la miscela di sfere magnetiche e RNA in un termociclatore ed eseguire il seguente programma: 65°C, 5 min; 25°C, 5 min; 25°C, attesa.

5) Posizionare il tubo su un supporto magnetico scaffale per 5 minuti per separare l'mRNA dall'RNA totale. Rimuovere con attenzione il surnatante.

6) Rimuovere il tubo dal magnete scaffale e risospendere le biglie magnetiche con 200 μL di Beads Wash Buffer. Pipettare l'intero volume su e giù 6 volte per mescolare accuratamente. Posizionare la provetta su un supporto magnetico scaffale per 5 minuti e rimuovere con attenzione il surnatante.

7) Ripetere il passaggio 6.

8) Rimuovere il tubo dal magnete scaffaleAggiungere 50 μl di tampone Tris per risospendere le sfere magnetiche e pipettare 6 volte per mescolare accuratamente.

9) Inserire il campione in un termociclatore ed eseguire il seguente programma per eluire l'mRNA: 80°C, 2 min; 25°C, attesa.

10) Rimuovere il campione dal termociclatore. Aggiungere 50μL di Beads Binding Buffer e pipettare ripetutamente 6 volte per mescolare accuratamente.

11) Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire all'mRNA di legarsi alle sfere magnetiche.

12) Posizionare il tubo sul magnete lasciare raffreddare per 5 minuti e rimuovere con attenzione il surnatante.

[Nota]: è necessaria una pipetta da 10 μL per aspirare il liquido rimanente.

13) Togliere il tubo dal magnete scaffale, risospendere le sfere magnetiche con 200 μL di Beads Wash Buffer, pipettare ripetutamente 6 volte per mescolare accuratamente. Posizionare la provetta sul magnetico scaffale a temperatura ambiente per 5 minuti. Rimuovere e scartare tutto il surnatante.

14) Eluizione finale dell'mRNA

Schema A: Per la reazione di trascrizione di riserva

Togliere il tubo dal magnetico scaffaleAggiungere 12μL di acqua priva di nucleasi e pipettare ripetutamente 6 volte per mescolare accuratamente. Posizionare la provetta nel termociclatore ed eseguire il seguente programma: 80°C, 2 min. Quindi posizionare il tubo sul magnetico scaffale immediatamente, lasciare a temperatura ambiente per 5 min. Dopo che la soluzione è chiarificata, aspirare con attenzione 10 μL di surnatante in un'altra nuova provetta per PCR priva di nucleasi.

Schema B: Per l'RNA preparazione della biblioteca

Aggiungere il volume appropriato di Frag/Primer Buffer secondo le istruzioni del kit pertinente per la costruzione della libreria.

Nota

1. Per la vostra sicurezza e salute, vi preghiamo di indossare camici da laboratorio e guanti monouso durante il funzionamento.
2. Solo per uso di ricerca.
3. Prima di utilizzare le sfere magnetiche, assicurarsi di riscaldarle a temperatura ambiente e di mescolarle bene, altrimenti l'efficienza di recupero dei campioni potrebbe essere compromessa.
4. L'operazione deve essere assolutamente priva di contaminazione da RNasi e acidi nucleici.
5. Se questo prodotto viene utilizzato con altri reagenti, seguire le istruzioni sperimentali specifiche per il funzionamento.
6. Per ottenere buoni risultati di purificazione, è necessario avere una buona integrità dell'RNA totale e garantire che il valore RIN sia >7,0.