Sonda di deplezione dell'mRNA della globina (umana) è progettato per rimuovere l'mRNA della globina umana. Può rimuovere efficacemente l'mRNA della globina da adulti, neonati ed embrionicarino fonti, tra cui HBA1/2, HBB, HBD, HBM, HBG1/2, HBE1, HBQ1 e HBZ. Questo prodotto è utilizzato con Hieff NGS^TM MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen#12253) per rimuovere efficacemente rRNA e mRNA di globina dall'RNA totale. Questo kit è adatto sia per campioni di RNA intatti che degradati. I campioni di RNA dopo la rimozione di rRNA e mRNA di globina possono essere utilizzati per analisi di sequenziamento ad alto rendimento di mRNA e RNA non codificante, che migliorano significativamente la proporzione di dati validi nei risultati di sequenziamento e nella sintesi di cDNA o altre applicazioni a valle.

Applicazione del prodotto

Adatto per campioni di RNA umano totale da 100 ng~1 μg, risorse di sangue di topi e ratti, e per campioni di RNA sia intatti che parzialmente degradati.

Componenti del prodotto

Spedizione e stoccaggio

Tutti i componenti vengono spediti con ghiaccio secco e possono essere conservati a -20°C per un anno.

Figura

Un totale di 500ng e 100ng di RNA totale del sangue umano sono stati sottoposti rispettivamente alla rimozione dell'rRNA e alla rimozione combinata di rRNA e globina. Dopo la costruzione della libreria e il sequenziamento, è stato confrontato il contenuto di mRNA della globina.

Attenzione

1. Si prega di utilizzare materiali di consumo privi di contaminazione da RNasi e di pulire regolarmente l'area sperimentale. Si consiglia di utilizzare RNAZap di ThermoFisher^TM Spray ad alta efficienza per la rimozione degli acidi nucleici, per eliminare la contaminazione da RNasi.

2. Il campione di RNA deve essere privo di contaminazione da DNA genomico. Se il gDNA rimane nel campione, deve essere digerito dalla DNasi I e purificato prima dell'uso.

3. Il volume massimo di input del campione di RNA è 10 μL. Se il volume del campione è grande, può essere concentrato prima.

4. Per la vostra sicurezza e salute, vi preghiamo di indossare camici da laboratorio e guanti monouso durante il funzionamento.

5. Solo per uso di ricerca!

Istruzioni

1. Ibridazione della sonda all'RNA

1.1 Diluire 10 ng–1 μg di RNA totale con acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 10 μL in una provetta per PCR. Mantenere l'RNA sul ghiaccio.

1.2 assemblare la seguente reazione di ibridazione RNA/sonda sul ghiaccio secondo la Tabella 1.

Tabella 1 Reazione di ibridazione RNA/sonda

1.3 Mescolare accuratamente pipettando delicatamente su e giù almeno 10 volte. Centrifugare brevemente la provetta in una microcentrifuga per raccogliere il liquido dal lato della provetta.

1.4 Posizionare la provetta in un termociclatore ed eseguire il seguente programma nella Tabella 2 con il coperchio riscaldato impostato a 105°C.

Tabella 2 Programma di reazione dell'ibridazione RNA/sonda

2. Digestione RNasi H

2.1 Assemblare la seguente reazione di digestione RNasi H sul ghiaccio secondo la Tabella 3.

Tabella 3 Reazione di digestione RNasi H

2.2 Mescolare accuratamente pipettando delicatamente su e giù almeno 10 volte. Centrifugare brevemente la provetta in una microcentrifuga per raccogliere il liquido dal lato della provetta.

2.3 Posizionare la provetta in un termociclatore ed eseguire il seguente programma: coperchio 50°C; 37°C, 30 minuti; 4°C, tenere.

3. DNasi IO Digestione

3.1 Assemblare la seguente reazione di digestione della DNasi I su ghiaccio secondo la Tabella 4.

Tabella 4 Reazione di digestione della DNasi Ⅰ

3.2 Mescolare accuratamente pipettando delicatamente su e giù almeno 10 volte. Centrifugare brevemente la provetta in una microcentrifuga per raccogliere il liquido dal lato della provetta.

3.3 Posizionare la provetta in un termociclatore ed eseguire il seguente programma: coperchio aperto; 37°C, 30 minuti; 4°C, tenere.

4. Purificazione dell'RNA

4.1 Equilibrare l'Hieff NGS^TMRNA Cleaner (Cat#12602) a temperatura ambiente e risospendere accuratamente le sfere agitandole tramite vortex prima dell'uso.

4.2 Aggiungi 110 µl (2,2×) perle alla soluzione di RNA del passaggio 3.3 e mescolare accuratamente pipettando su e giù almeno 10 volte.

4.3 Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti per legare l'RNA alle perle.

4.4 Posizionare la provetta su un supporto magnetico per separare le microsfere dal surnatante. Quando la soluzione è limpida (circa 3 minuti), scartare il surnatante. Fare attenzione a non toccare le perle con le punte delle pipette.

4.5 Mantenere il tubo sul supporto magnetico. Aggiungere 200 µL di etanolo all'80% appena preparato alla provetta. Incubare a temperatura ambiente per 30 secondi e quindi scartare il surnatante. Fare attenzione a non toccare le perle con le punte della pipetta.

4.6 Ripetere il passaggio 4.5 una volta per un totale di due lavaggi.

4.7 Rimuovere l'etanolo residuo con 10 µL - punte per pipette. Tenere il tubetto sul supporto magnetico e lasciare asciugare le perle all'aria per un massimo di 5 minuti con il coperchio aperto.

4.8 Togliere la provetta dal supporto magnetico. Eluire l'RNA dalle perle aggiungendo 11 μL di acqua priva di nucleasi. Mescolare accuratamente pipettando su e giù almeno 10 volte e far girare brevemente la provetta.

4.9 Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Posizionare la provetta sul supporto magnetico finché la soluzione non diventa limpida (~ 3 minuti).

4.10 Trasferire 10 µL del surnatante in una provetta priva di nucleasi.

Nota: se è necessario fermarsi a questo punto, i campioni possono essere conservati a -80°C.