Hieff NGS^TM Il kit di preparazione della libreria del DNA è un kit di costruzione di librerie di nuova generazione, sviluppato e progettato appositamente per Illumina® &MGI® piattaforma di sequenziamentoSulla base della precedente generazione di kit di costruzione di librerie, questo prodotto mostra una maggiore efficienza nella riparazione delle estremità, nel dA-tailing e nella legatura dell'adattatore rispetto alle versioni precedenti. L'enzima ad alta fedeltà migliora significativamente l'uniformità e la fedeltà dell'amplificazione. Il kit è compatibile con la maggior parte dei tipi di campioni di DNA, tra cui il DNA genomico standard di animali/piante/microrganismi, campioni FFPE, cfDNA e DNA ChIP.

Specifiche

Componenti

Magazzinaggio

Questo prodotto deve essere conservato a -25~-15℃ per 1 anno.

Appunti

1. Informazioni sull'operazione

1Per la vostra sicurezza, si prega di operare indossando camici da laboratorio e guanti monouso.

2. Scongelare i componenti a temperatura ambiente. Dopo lo scongelamento, mescolare accuratamente mediante vortex, centrifugare brevemente la provetta e riporla nel ghiaccio per un uso successivo.

3. Quando si prepara la soluzione di reazione di ogni passaggio, si raccomanda di usare una pipetta per mescolare bene o agitare delicatamente. Un'agitazione vigorosa può causare una diminuzione dell'output della libreria.

4. Si raccomanda vivamente di utilizzare puntali per pipette filtrati per evitare contaminazioni incrociate. Assicurarsi di cambiare i puntali per pipette quando si elaborano campioni diversi.

5. Operazioni improprie possono molto probabilmente causare contaminazioni da aerosol, influenzando l'accuratezza del risultato. Si raccomanda l'isolamento fisico obbligatorio delle regioni di miscelazione della reazione PCR e delle regioni di analisi della purificazione del prodotto PCR. Dotato di apparecchiature quali pipette specializzate per la costruzione di librerie.Eseguire una pulizia di routine per ogni area pulendo le superfici con ipoclorito di sodio allo 0,5% o candeggina al 10%.

6Questo prodotto è destinato esclusivamente alla ricerca.

2. Frammentazione del DNA

1. Questo kit è compatibile sia con DNA frammentato meccanicamente che con DNA frammentato enzimaticamente.

2. Il kit è compatibile con 100 pg - 1000 ng di DNA di input. Si raccomanda vivamente di utilizzare DNA di input di alta qualità con A260/A280 = 1,8-2,0. La Tabella 1 elenca la quantità di DNA di input raccomandata.

Tabella 1 Quantità di DNA di input consigliata

Nota: Quando il DNA di input è di scarsa qualità o è richiesta una selezione delle dimensioni del DNA, la quantità di DNA di input deve essere aumentata di conseguenza.

3.Con "DNA di input" si intendono specificatamente i campioni di DNA pronti per la riparazione delle estremità/dA tailing.

4. Si raccomanda una fase di purificazione delle perle/selezione delle dimensioni dopo la frammentazione se il campione di DNA in ingresso contiene alte concentrazioni di sali come l'agente chelante dei metalli. I sali potrebbero influire sull'efficienza delle seguenti reazioni, tra cui la riparazione delle estremità e il dA-tailing. Si prega di eluire i campioni di DNA in tampone TE anziché in acqua ultrapura sterilizzata per la frammentazione se si utilizza il metodo di frammentazione meccanica. Se si utilizza il metodo di frammentazione enzimatica senza eseguire la pulizia delle perle o la selezione delle dimensioni prima di procedere alla preparazione della libreria, assicurarsi che il tampone di arresto utilizzato non contenga un eccesso di agente chelante dei metalli. In caso contrario, si prega di pulire o selezionare le dimensioni dei campioni frammentati ed eluirli in tampone TE o acqua ultrapura sterilizzata (≤50 μL) prima di procedere alla preparazione della libreria.

3. Legatura dell'adattatore

1. I kit Illumina o MGI Long Adapter (Barcoded Adapter) e short Adapter sono disponibili tra cui i clienti possono scegliere in base alle proprie esigenze sperimentali.

2. Si raccomanda di selezionare adattatori commerciali di alta qualità. Se si selezionano adattatori fatti in casa, si prega di affidarsi a un'azienda con esperienza nella sintesi di primer NGS e di sottolineare la necessità di un rigoroso controllo della contaminazione. Inoltre, si raccomanda di preparare la soluzione di annealing del DNA in un banco pulito e di utilizzare un solo tipo di adattatore alla volta per evitare la contaminazione incrociata..

3. Si prega di scongelare gli adattatori sul ghiaccio o a 4°C; quando si utilizza a temperatura ambiente, la temperatura del laboratorio non deve superare i 25°C per evitare che gli adattatori si denaturano.

4. La qualità e la concentrazione degli adattatori influenzeranno direttamente l'efficienza della legatura e la resa della libreria. Una concentrazione troppo elevata di adattatori favorisce la formazione di dimeri di adattatori, mentre una concentrazione troppo bassa di adattatori riduce la velocità di legatura e la resa della libreria. Diluizioni corrispondenti con TE Buffer in base alla quantità di DNA in ingresso quando si utilizza Adapter.Tabella 2 -5 elenca i metodi di diluizione dell'adattatore consigliati per diverse quantità di DNA di input utilizzando questo kit.

Tavolo 2 L'Illumina consigliata^TM quantità adattatore per input diversi Il DNA

Tavolo 3 Il MGI consigliato^TM quantità adattatore per input diversi Il DNA

Tavolo 4 L'Illumina consigliata^TM UMI quantità adattatore per input diversi Il DNA

Tavolo 5 Il MGI consigliato^TM UMI adattatore aMconteggio per input diversi Il DNA

4. Pulizia del DNA basata su microsfere e selezione delle dimensioni

1. La selezione delle dimensioni del DNA può essere eseguita prima della riparazione dell'estremità/dA-tailing, dopo la legatura dell'adattatore o dopo l'amplificazione.

2. Si consiglia di eseguire la selezione delle dimensioni subito dopo la legatura dell'adattatore se la quantità di DNA in ingresso è superiore a 50 ng; in caso contrario, eseguire la selezione delle dimensioni dopo l'amplificazione.

3. Il Ligation Enhancer contiene un'elevata concentrazione di PEG, che può avere un impatto significativo sulla selezione accurata delle dimensioni. Pertanto, se la selezione delle dimensioni deve essere eseguita subito dopo la legatura dell'adattatore, si consiglia vivamente di aggiungere una fase di pulizia delle perle prima della selezione delle dimensioni. La fase di selezione delle dimensioni può essere eseguita direttamente se eseguita prima della riparazione finale/dA-tailing o dopo l'amplificazione della libreria.

4. Le sfere magnetiche devono essere portate a temperatura ambiente prima dell'uso, altrimenti la resa diminuirà e l'effetto di selezione delle dimensioni sarà compromesso.

5. Prima dell'uso, le sfere magnetiche devono essere mescolate bene tramite vortex o pipettaggio.

6. Non aspirare le microsfere durante il trasferimento del surnatante, anche tracce di microsfere potrebbero influire sulle reazioni successive.

7. L'etanolo all'80% deve essere preparato fresco, altrimenti l'efficienza del recupero ne risentirà.

8. Per una selezione accurata delle dimensioni, si consiglia di iniziare con un volume superiore a 100 μL. Se inferiore, si consiglia di portare il volume fino a 100 μL con acqua ultra-pura.

9. Le perle magnetiche devono essere asciugate a temperatura ambiente prima di eluire il prodotto. Una secchezza insufficiente causerà facilmente l'alterazione delle reazioni successive da parte dei residui di etanolo; una secchezza eccessiva causerà la rottura delle perle magnetiche e ridurrà la resa di purificazione. Normalmente, l'essiccazione a temperatura ambiente per 3-5 minuti è sufficiente per consentire alle perle di asciugarsi completamente.

10. Se necessario, i campioni di DNA purificati o selezionati in base alle dimensioni vengono eluiti in 0,1× Il tampone TE può essere conservato a 4°C per 1-2 settimane o a -20°C per un mese.

5. Amplificazione della libreria

1. L'esecuzione o meno dell'amplificazione della libreria dipende dalla quantità di DNA in ingresso, dai tipi di adattatori, dalle applicazioni dei dati di sequenziamento, ecc. La fase di amplificazione è richiesta se si utilizzano adattatori parziali. Quando si utilizzano adattatori a lunghezza intera, se il DNA in ingresso è <200 ng, si consiglia di eseguire l'amplificazione; in caso contrario, l'amplificazione non è necessaria.

2. I numeri dei cicli di amplificazione devono essere rigorosamente controllati. Un'amplificazione insufficiente può portare a una bassa resa della libreria; una sovra-amplificazione può introdurre un aumento di bias, errori, letture duplicate e prodotti chimerici. Tabella 6 elenca i numeri di cicli consigliati per ottenere una resa della libreria di 1 μg.

Tavolo 6 Il numero di cicli consigliato per generare 1.000 ng di resa della libreria

Nota：

1.Tavolo 6 mostra il numero di parametri del loop utilizzando test del DNA di input di alta qualità di circa 200 bp. La qualità del DNA FFPE varia notevolmente e quando la qualità del DNA è scarsa o la lunghezza della libreria è elevata, il numero di cicli deve essere opportunamente aumentato per ottenere librerie sufficienti.

2.IOSe è richiesta la selezione delle dimensioni durante il processo di creazione della libreria, si consiglia un numero di cicli più elevato per l'amplificazione della libreria; in caso contrario, si consiglia un numero di cicli più basso.

3.IOSe vengono utilizzati adattatori incompleti, è necessario amplificare almeno 2 cicli per formare un adattatore completo.

6. Analisi della qualità della biblioteca

1. La qualità delle librerie costruite viene generalmente analizzata misurando le concentrazioni e le distribuzioni dimensionali.

2. Biblioteche'le concentrazioni possono essere misurate mediante metodi basati sulla fluorescenza come Qubit e PicoGreen o qPCR.

3.NON è consigliato l'uso di metodi di quantificazione basati sull'assorbanza come NanoDrop.

4. Si raccomanda di utilizzare il metodo qPCR per la quantificazione delle librerie: i metodi basati sulla fluorescenza come Qubit e PicoGreen non possono differenziare le strutture dsDNA incomplete (inserti senza adattatore o con solo una delle estremità legata con adattatore) dalle librerie complete. Il metodo qPCR amplificherà e misurerà solo le librerie complete con entrambe le estremità legate con adattatori (le librerie sequenziabili), fornendo così una misurazione più accurata per il caricamento.

5. La distribuzione dimensionale delle librerie può essere analizzata utilizzando Agilent Bioanalyzer o altri dispositivi basati sui principi dell'elettroforesi capillare o della microfluidica.

7. Altri materiali

1. Perle magnetiche per la purificazione del DNA: Hieff NGS^TM Perle di selezione del DNA (Yeasen Cat#12601) o AMPure^® Perline XP (A63880) o altri prodotti equivalenti.

2. Adattatori: Adattatore completo per Illumina: Yeasen Cat#13519-13520; 384 Primer CDI doppi:Sì Cat#12412~Cat#12413; 384 Primer a doppio indice univoco (UDI): Sììì Gatto n. 12312~Gatto#12315; Adattatori UMI UDI:Sì Cat#13370~Cat#13371; Adattatore completo per MGI: Yeasen Cat#13360-13362. Miscela di primer del DNA:Gatto#12190 O Gatto#12191.

3. Analisi della qualità della libreria: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip o altri prodotti equivalenti; reagenti quantitativi della libreria.

4. Altri materiali: etanolo assoluto, acqua ultrapura sterile, punte per pipette a bassa ritenzione, provetta per PCR, supporti magnetici, termociclatore, ecc.

Istruzioni

Fase 1. Riparazione finale/dA-Taling

1. Scongelare i reagenti menzionati nella Tabella 7 Capovolgere per mescolare accuratamente i reagenti e riporli sul ghiaccio per un uso successivo.

2. Assemblare i reagenti secondo la tabella 7 sul ghiaccio.

Tavolo 7 Sistema di reazione di riparazione finale/dA-Tailing

3. Mescolare delicatamente pipettando o agitando, centrifugare brevemente per ottenere la soluzione.

4. Posizionare la provetta in un termociclatore e impostare il programma secondo la tabella 8.

Tavolo 8 Riparazione finale/dA-Tailing programma di reazione

Fase 2. Legatura dell'adattatore

1. Diluire l'adattatore alla concentrazione appropriata secondo la Tabella 2-5.

2. Scongelare i reagenti menzionati nella Tabella 9 Capovolgere per mescolare accuratamente i reagenti e riporli sul ghiaccio per un uso successivo.

3. Assemblare i reagenti secondo la tabella 9 sul ghiaccio.

Tavolo 9 Legatura dell'adattatore Rifsistema di azione

Nota: *Il Ligation Enhancer è viscoso. Si prega di mescolare accuratamente capovolgendo o vertexando e centrifugare brevemente prima dell'uso.

**La concentrazione originale del Illumina^TM l'adattatore di YEASE è 15 μM. Si prega di diluire l'adattatore in base alla quantità di input E fissare il volume dell'adattatore a 5 μL.

**La concentrazione originale del MGI^TM l'adattatore di YEASE è 10 μM. Si prega di diluire l'adattatore in base alla quantità di input E fissare il volume dell'adattatore a 5 μL.

4. Mescolare accuratamente pipettando delicatamente su e giù e centrifugare brevemente per raccogliere tutto il liquido dai lati della provetta..

5. Incubare il campione in un termociclatore preriscaldato come mostrato nella Tabella 10 ed eseguire la reazione di connessione dell'adattatore.

Tavolo 10 Programma di reazione di legatura dell'adattatore

Fase 3. Pulizia o selezione delle dimensioni dopo la legatura dell'adattatore

Questo passaggio serve a purificare o selezionare le dimensioni del prodotto nel passaggio 2 con perle magnetiche. La purificazione può rimuovere adattatori residui, dimeri di adattatori o altri prodotti inutilizzabili.

PulitoN di DNA legato all'adattatore

1. Preparazione: effettuare l'Hieff NGS^TM DNA Selection Beads fuori dal frigo e lasciare equilibrare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Preparare etanolo all'80% fresco.

2. Mescolare accuratamente le perle capovolgendole o mettendole in verticale.

3. Aggiungere 88 microlitro Hieff NGS^TM Perle di selezione del DNA (0.8×, Perle: DNA = 0.8:1) nella provetta contenente il prodotto legato all'adattatore, agitare e mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.

4. Centrifugare brevemente per far scendere la soluzione e posizionare la provetta da centrifuga sul rack magnetico. Dopo che le sfere magnetiche sono completamente assorbite (circa 5 min), rimuovere con attenzione il liquido.

5. Mantenere il tubo sul supporto magnetico, aggiungere direttamente 200 μL di etanolo all'80% appena preparato alla provetta. Incubare a temperatura ambiente per 30 secondi e rimuovere con attenzione il liquido.

6. Ripetere di nuovo il passo 5.

7. Tenere la provetta sul supporto magnetico, aprire il tappo e far asciugare le perle finché non si saranno appena screpolate (non più di 5 minuti).

8. Togliere la provetta dal supporto magnetico per l'eluizione ed eluire il DNA

1) La parola "amore" significa "amore". Se il prodotto non necessita di selezione dimensionale, aggiungere 21 μL ddH₂O direttamente. Mescolare accuratamente agitando o pipettando su e giù 10 volte. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare brevemente la provetta e posizionarla su un supporto magnetico. Quando la soluzione è limpida (circa 5 min), trasferire 20 μL di surnatante in una nuova provetta per PCR con attenzione senza toccare le biglie magnetiche.

2). Se il prodotto deve essere selezionato in base alle dimensioni, aggiungere 102 μL ddH₂O direttamente. Mescolare accuratamente agitando o pipettando su e giù 10 volte. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare brevemente la provetta e posizionarla su un supporto magnetico. Quando la soluzione è limpida (circa 5 min), trasferire 100 μL di surnatante in una nuova provetta per PCR con attenzione senza toccare le biglie magnetiche.

Nota: Se il prodotto purificato deve essere conservato, può essere eluito con il tampone TE.

Selezione delle dimensioni del DNA legato all'adattatore

1.Preparazione: effettuare l'Hieff NGS^TM DNA Selection Beads fuori dal frigo e lasciare equilibrare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Preparare etanolo all'80% fresco.

2. Mescolare accuratamente le perle capovolgendole o mettendole in verticale.

3. In base alle dimensioni desiderate, aggiungere il primo giro di perle ai 100 μL di modelli di DNA purificati secondo la Tabella 11Mescolare accuratamente agitando con vortex o pipettando 10 volte.

Tavolo 11 Perle consigliate: rapporti di DNA per la selezione delle dimensioni in base alle perle

Nota: "×" nella tabella indica il volume del campione di DNA. Ad esempio, se la lunghezza dell'inserto della libreria è 250 bp e il volume del campione di DNA è 100 μL, il volume delle sfere magnetiche utilizzate nel primo ciclo di ordinamento è 0,7×100 μL=70 μL; il volume delle sfere magnetiche utilizzate nel secondo ciclo di ordinamento è 0,20×100 μL=20 μL. Il volume di sfere consigliato nella tabella è per il DNA legato all'adattatore. Se la procedura di selezione delle dimensioni viene eseguita prima della legatura, fare riferimento ai protocolli di fabbricazione di Hieff NGS^TM Perline di selezione del DNA (Cat#12601).

4. IOIncubare a temperatura ambiente per 5 minuti.

5. Centrifugare brevemente la provetta e posizionarla su un supporto magnetico. Quando la soluzione è limpida (circa 5 min), trasferire il surnatante in una nuova provetta per PCR.

6. Aggiungere il secondo giro di perle di selezione al campione del passaggio 5 secondo la tabella 11.Mescolare accuratamente agitando con il vortex o pipettando su e giù almeno 10 volte.

7. IOIncubare a temperatura ambiente per 5 minuti.

8. Centrifugare brevemente per far scendere la soluzione e posizionare la provetta da centrifuga sul rack magnetico. Dopo che le sfere magnetiche sono completamente assorbite (circa 5 min), rimuovere con attenzione il liquido.

9. Mantenere il tubo sul supporto magnetico, aggiungere direttamente 200 μL di etanolo all'80% appena preparato alla provetta. Incubare a temperatura ambiente per 30 secondi e rimuovere con attenzione il liquido.

10. Ripetere fare un passo 9 Ancora.

11. Tenere la provetta sul supporto magnetico, aprire il tappo e far asciugare le perle finché non si saranno appena screpolate (non più di 5 minuti).

12. Togliere la provetta dal supporto magnetico per l'eluizione, E aggiungere direttamente 21 μL ddH₂O. Mescolare accuratamente con vortex o pipettando su e giù e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. (Nota: se è necessario conservare il prodotto purificato, eluire in TE Buffer.) Centrifugare brevemente la provetta e posizionarla su un supporto magnetico finché il liquido non diventa limpido (circa 5 minuti). Trasferire con attenzione 20 μL di surnatante in una nuova provetta per PCR senza toccare le perle.

Passo 4 Amplificazione della libreria

Questo passaggio può arricchire i prodotti purificati o selezionati in base alle dimensioni mediante amplificazione PCR.

1. Scongelare l'elenco dei reagenti nella tabella 12, capovolgere e mescolare accuratamente, quindi riporre sul ghiaccio per un uso successivo.

2. Preparare la seguente reazione in una provetta PCR sterilizzata.

Tavolo 12 reazione PCR del DNA legato all'adattatore sistema

[Nota]: * se è stato utilizzato l'adattatore completo, Hieff NGS^TM Miscela di primer (Gatto Yeasen n. 12190 o Cat#12191) in necessità; Se viene utilizzato un adattatore incompleto (Cat#12412~Cat#12413, Cat#12312~Gatto#12315, Cat#13370~Cat#13371), fare riferimento alle istruzioni del kit e utilizzare l'Index Primer fornito nel kit per l'amplificazione.

3. Mescolare delicatamente pipettando o agitando e centrifugare brevemente per far scendere la soluzione.

4. Inserire la provetta in un termociclatore e impostare il programma secondo la tabella 13 per iniziare l'amplificazione.

Tavolo 13 Programma di reazione di amplificazione PCR

Passo 5 Pulizia post-amplificazione/selezione delle dimensioni

Il pulito i gradini in alto si riferiscono a fare un passo 3. NGS di Hieff^TM Per la purificazione del prodotto PCR vengono utilizzate le perle di selezione del DNA (0,9×, perle:DNA=0,9:1). Se è necessaria la selezione delle dimensioni, fare riferimento a fare un passo 3.

Passo 6 Controllo di qualità delle librerie finali

La qualità della libreria costruita viene generalmente valutata misurando la concentrazione e la distribuzione dimensionale. Per i dettagli, fare riferimento alla Nota 6.