Alta qualità™ Kit sonda RT-qPCR Multiplex One Step V (UDG Più) è un kit di PCR quantitativa multiplex basato sull'RNA come stampo. Nel corso dell'esperimento, la trascrizione inversa e la PCR quantitativa sono state eseguite nella stessa provetta, il che ha semplificato l'operazione sperimentale e ridotto il rischio di contaminazione.

In questo kit, il primo filamento di cDNA è stato sintetizzato in modo efficiente da Hifair resistente al calore^TM V Trascrittasi inversa e amplificata quantitativamente da UNICON^TM HotStart Taq DNA Polymerase. Il kit contiene principalmente tampone MP ottimizzato, mix di enzimi, ecc. La soluzione tampone contiene già Mg²⁺ e dNTP. Inoltre, vengono aggiunti i fattori che possono inibire efficacemente l'amplificazione PCR non specifica e migliorare l'efficienza di amplificazione di più reazioni qPCR, il che può garantire l'efficienza di amplificazione e portare a termine fino a più reazioni di amplificazione. Il sistema dUTP/UDG è stato aggiunto per prevenire efficacemente il rischio di contaminazione da aerosol.

Caratteristiche

Alta sensibilità：Il sistema tampone attentamente ottimizzato migliora la sensibilità di rilevamento dei modelli a bassa concentrazione fino a 250 copie/mL；

Massima stabilità: il prodotto ha superato i test di stabilità in tempo reale per 18 mesi.

Sistema antinquinamento dUP/UDG：Il sistema anti-inquinamento dUTP/UDG è stato introdotto per degradare efficacemente l'inquinamento da aerosol dei prodotti, ridurre i falsi positivi e garantire risultati autentici；

Supporta il programma veloce: compatibile con il programma veloce, 40 minuti possono produrre risultati;

Componenti

Nota: 1) 2×Hifair^TM Tampone MP V è l'abbreviazione di Hifair^TM Tampone sonda RT-qPCR Multiplex One Step V, che include dNTP, dUTP, Mg2+, stabilizzatori, potenziatori e altro ancora.

2) Hifair^TM Miscela di enzimi V contiene principalmente Hifair resistente al calore^TM Trascrittasi inversa V, UNICONTM HotStart Taq DNA polymeras e Gas UD.

Magazzinaggio

TLui prodotto Dovrebbe Essere immagazzinato A -25°C~-15°C per 18 mesi.

Istruzioni

Composizione della reazione

Nota：Assicurarsi di mescolare bene prima dell'uso, evitando la formazione di bolle eccessive causate da vibrazioni violente.

a) Primer/Sonda concentrazione: Primer miscela comprendente primer multiplex, a seconda della situazione, la concentrazione ottimale del primer può essere compresa tra 0,1 e 1,0 μM.Miscela di sonde che include la differenza di marcatura della sonda multiplex, gruppo fluorescente; a seconda della situazione, la concentrazione ottimale della sonda può essere compresa tra 0,05 e 0.5 unità di misura.

c) Diluizione del template: la qPCR è altamente sensibile e si raccomanda di diluire il template. Il valore Ct di controllo è adatto tra 20 e 35.

D) Preparazione del sistema: svitare la testa con l'elemento filtrante. Evitare la contaminazione incrociata e la contaminazione da aerosol.

Protocollo di ciclismo ottimizzato

Nota：a) L'trascrizione inversa: La temperatura può essere selezionata a 42°C o 50°C per 10-15 minuti.

b) Reazione di amplificazione: la temperatura viene regolata in base al valore Tm dei primer progettati.

C) Acquisizione del segnale di fluorescenza: Impostare la procedura sperimentale in base ai requisiti del manuale dello strumento.

3. Applicazione attrezzatura

Attrezzatura con Rox：ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Veloce, StepOne™, StepOne Plus™

Attrezzatura con Low Rox：ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 e 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex

Prodotti Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™

Attrezzatura senza Rox：

Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™

Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000

Scienza applicata Roche Ciclo di lavaggio LightCycler® 480, Ciclo di lavaggio LightCycler® 2.0, Ciclo di lavaggio LightCycler® 96

Termo Ciclore scientifico PikoReal; Cefeide Dispositivo SmartCycler®; Illumina Eco qPCR

Appunti

Si prega di indossare i DPI necessari, come camice e guanti, per garantire la propria salute e sicurezza!

Si prega di utilizzare materiali di consumo privi di RNasi per l'esperimento.

Test di sensibilità

I 13650 conservati a -20°C per 18 mesi (gruppo sperimentale) e quelli entro la data di scadenza (gruppo di controllo) sono stati testati simultaneamente per la diluizione a gradiente (500 copie/ml, 250 copie/ml) dello pseudovirus SARS-CoV-2, che ha come target il gene ORF e il gene N. Sono stati testati otto pozzetti replicati per ciascuna concentrazione, con un tasso di rilevamento del 100%. Inoltre, non vi sono state differenze significative nelle forme dei picchi della curva di amplificazione e nei valori Ct.

Test di stabilità in tempo reale

I 13650 conservati a -20°C per 18 mesi e quelli entro la loro data di scadenza. Entrambi i gruppi sono stati testati simultaneamente per il gene ORF dello pseudovirus SARS-CoV-2 e il gene N a una concentrazione di 1000 copie/ml con 20 pozzetti replicati. Il tasso di rilevamento per entrambi è stato del 100% e non vi sono state differenze significative nella forma delle curve di amplificazione o nei valori Ct.

Figura 1. Red: 13650 entro la loro data di scadenza；blu：13650 conservato a -20°C per 18 mesi.

Prestazioni stabili dopo ripetuti cicli di congelamento-scongelamento

Sottoponendo il reagente 13650 a 30 e 50 cicli di congelamento-scongelamento utilizzando ghiaccio secco, insieme ai reagenti conservati normalmente a -20°C e testando simultaneamente il gene ORF del pseudovirus SARS-CoV-2, i risultati hanno indicato che le prestazioni del reagente 13650 non sono state influenzate dopo 50 cicli di congelamento-scongelamento.

Figura 2. Rosso: 13650 conservato normalmente a -20°C; Viola：Da 13650 a 30 cicli di congelamento-scongelamento；Verde：Da 13650 a 50 cicli di congelamento-scongelamento.

Compatibile con protocolli standard e rapidi

Utilizzando 13650ES, il gene ORF e il gene N dello pseudovirus SARS-CoV-2 sono stati rilevati con lo stesso sistema di reazione con protocolli standard e rapidi. I risultati hanno mostrato che con un sistema 4-plex non c'era alcuna differenza nelle forme dei picchi della curva di amplificazione e nei valori Ct tra i due protocolli.

Documenti:

Manuali