Il kit è dotato di un potente tampone di lisi, che può lisare rapidamente i campioni (ad esempio cellule, coda di topo, orecchio di topo, dita di topo, muscoli, ecc.) per rilasciare DNA genomico e il lisato può essere aggiunto direttamente al sistema di reazione PCR senza purificazione, il che è conveniente per il funzionamento. Inoltre, questo kit richiede un basso input di campione, 5 mg di tessuto di topo o 1-5 mm di coda di topo possono essere utilizzati per gli esperimenti.

Componenti

Magazzinaggio

19697-A (La soluzione di lisi) deve essere conservata a 2~8℃ per 1 anni. Se utilizzato più volte, congelarlo in confezioni separate per evitare contaminazioni incrociate. 19687-B (Soluzione di arresto) dovrebbe essere conservato a -25~-16℃ per 1 anni.

Istruzioni

Rilascio del DNA genomico del topo

1. Inserire 5-10 mg di tessuto animale o 1-5 mm di coda di topo in una provetta da centrifuga da 1,5 mL*.
2. Aggiungere 90 μL di Buffer ML alla provetta da centrifuga sopra indicata, agitare delicatamente per infiltrare completamente il campione con il lisato e centrifugare brevemente.
3. Incubare a 95°C per 15 minuti in un incubatore termostatico**.
4. Aggiungere 10 μL di Buffer MT, agitare per mescolare e terminare la lisi.
5. Fase facoltativa: centrifugazione a 12000 giri/min per 2 min.
6. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga e conservare a 4°C o -20°C oppure prelevare direttamente il surnatante per la successiva amplificazione PCR.

* Per consentire alla reazione di lisi di procedere più agevolmente, il tessuto deve essere tagliato il più possibile.

**L'incubazione a 95°C per 15 min è generalmente sufficiente per la maggior parte delle esigenze di PCR. Se è richiesta una quantità maggiore di DNA o il campione è difficile da lisare, il tempo può essere esteso a 30 min. Il blocco di tessuto non deve essere completamente lisato e il residuo può essere rimosso in una successiva fase di centrifugazione.

Rilascio del DNA genomico cellulare

Dopo aver coltivato le cellule transfettate in una piastra da 48 pozzetti per 3 giorni e aver raggiunto una densità cellulare di circa 70.000 cellule/pozzetto, rimuovere il mezzo il più completamente possibile. Quindi aggiungere 90 ul di tampone ML direttamente per pozzetto e pipettare ogni pozzetto. Trasferire il tutto nella piastra PCR da 96 pozzetti. Dopo aver trattato con una macchina PCR a 95 °C per 5-15 min e aver raffreddato, aggiungere 10 ul di tampone MT e soffiare uniformemente e accuratamente. Utilizzando un enzima ad alta fedeltà (Cat# 10164) o un enzima Taq, aggiungere 0,5-2 ul di lisato cellulare a ogni 50 ul di sistema di reazione PCR ed eseguire la PCR.

Figura 1. PCR diretta con lisato cellulare trattato con 19697.

Appunti

1. Questo prodotto è destinato esclusivamente alla ricerca.
2. Per la vostra sicurezza, utilizzate occhiali protettivi, camici da laboratorio e guanti monouso.
3. Per evitare contaminazioni incrociate tra campioni, è necessario immergere il bordo del dispositivo di campionamento o la parte a diretto contatto con il campione in una soluzione di ipoclorito di sodio al 2% dopo ogni campionamento, lavarlo più volte e quindi asciugare il liquido residuo con un tovagliolo di carta pulito prima di utilizzarlo nuovamente.Per facilitare l'esecuzione del test, è possibile preparare e pulire uniformemente diversi dispositivi di campionamento dopo l'uso, per garantire che ogni singolo campione venga campionato con un dispositivo di campionamento privo di contaminazione.
4. Si raccomanda di utilizzare tessuti animali appena prelevati. In caso di tessuti congelati a lungo termine, si dovrebbe evitare il più possibile il congelamento e lo scongelamento ripetuti, altrimenti ciò porterà alla degradazione del modello e influenzerà l'efficienza della PCR.

Documenti:

Manuali