L'amplificazione non specifica della Taq DNA polimerasi è un problema comune negli esperimenti PCR, che influisce direttamente sull'interpretazione dei risultati di rilevamento e può portare a una diminuzione della sensibilità di amplificazione e persino a una riduzione della resa del frammento target. Utilizzare modificatori enzimatici per sigillare il centro attivo della Taq DNA polimerasi a temperatura ambiente, inibendo così l'attività della DNA polimerasi dell'enzima Taq a temperatura ambiente, è attualmente il metodo più efficace per sopprimere l'amplificazione non specifica. Gli anticorpi a doppia tenuta sviluppati da Yisheng non solo sigillano l'attività della polimerasi della Taq DNA polimerasi, ma sigillano anche simultaneamente l'attività esonucleasica della Taq DNA polimerasi. Questo duplice approccio previene efficacemente l'amplificazione non specifica causata da mispairing o dimeri di primer e previene anche la generazione di segnali non specifici dovuti alla degradazione del materiale, migliorando così doppiamente la specificità del reagente. Ciò consente ai reagenti di rilevamento di affrontare facilmente il trasporto o l'uso a temperatura ambiente.

1.Specificità di amplificazione ultra-elevata: l'anticorpo a doppia tenuta può sigillare simultaneamente sia l'attività della polimerasi che quella dell'esonucleasi, evitando efficacemente l'amplificazione aspecifica e migliorando la specificità.

2.Eccezionale sensibilità di rilevamento: la formulazione hot-start garantisce un rilevamento efficace dei geni a bassa abbondanza, offrendo una maggiore sensibilità.

3.Eccezionale stabilità del prodotto: prestazioni stabili se conservato a 37°C per 5 giorni o a 4°C per 10 giorni.

4.Stabilità della linea di base e buona linearità: affronta il problema della deriva della linea di base, ottenendo un'eccellente linearità.

5.Rilascio rapido dell'attività enzimatica: oltre il 95% dell'attività enzimatica può essere rilasciato riscaldando a 95°C per 20 secondi.

6.Ampia applicabilità degli enzimi: adatti sia agli enzimi Taq selvatici che a quelli mutanti, con ogni mg di anticorpo in grado di sigillare 4-10 KU di enzima Taq.

1 Blocco dell'attività esonucleasica della Taq DNA polimerasi

Le sonde primer sintetiche sono state rispettivamente incorporate nelle miscele di reazione della Taq DNA polimerasi che erano o non sigillate o sigillate con anticorpi a doppia chiusura, e le reazioni sono state condotte a 40°C. Sono stati rilevati i segnali di fluorescenza di entrambi, e si è scoperto che gli anticorpi a doppia chiusura possono sigillare efficacemente l'attività esonucleasica della Taq DNA polimerasi.

Figura 2. Rilevamento dell'efficienza di sigillatura dell'attività dell'anticorpo-endonucleasi a doppia tenuta.

02 Verifica della sensibilità di rilevamento

Utilizzando rispettivamente l'anticorpo a doppia sigillatura di Yeasen e l'anticorpo della T Company per sigillare l'enzima Taq, seguito dal rilevamento di campioni positivi tramite tecnologia ARMS-PCR, si è scoperto che l'enzima Taq sigillato dall'anticorpo a doppia sigillatura di Yeasen era accurato nell'amplificazione ARMS-PCR con maggiore sensibilità.

Rosso:anticorpo YEASEN+Taq; Blu: anticorpo fornitore A+Taq.

Figura 3. Curva di amplificazione di ARMS-PCR.

03 Verifica della stabilità (4°C per 10 giorni, 37°C per 5 giorni).

Utilizzando anticorpi chiusi tradizionali e anticorpi a doppia chiusura per bloccare rispettivamente la Taq DNA polimerasi, la polimerasi viene quindi formulata in una soluzione premiscelata completa contenente primer e sonde. Questa soluzione viene lasciata a 4°C per 10 giorni o a 37°C per 1, 3 e 5 giorni, quindi utilizzata per amplificare 10.000 copie del plasmide ASF. È stato osservato che non vi erano cambiamenti significativi nelle curve di amplificazione e nei valori Ct.

Figura 4. Curve di amplificazione di 10.000 copie del plasmide ASF dopo che la Taq polimerasi è stata bloccata con l'anticorpo bloccante tradizionale (A) e l'anticorpo a doppio blocco (B), amplificate dal sistema di qPCR.

04 Rilevamento della linea di base

In determinate condizioni in cui vengono utilizzati primer specifici insieme a particolari tamponi e strumenti, può verificarsi un fenomeno noto come deriva della linea di base. Tuttavia, l'uso di anticorpi a doppia chiusura può affrontare efficacemente il problema della deriva della linea di base, facilitando così una linea di base più stabile.

Figura 5. Curve di amplificazione del gene N (A) e del gene ACT (B) del SARS-CoV-2 nell'analisi qPCR.

05 Verifica della linearità

La miscela di reazione sigillata con anticorpi a doppia chiusura è stata utilizzata per amplificare 100.000, 10.000, 1.000 e 100 copie del doppio plasmide ASFV/ACT per generare una curva standard. Come si può vedere dalla Figura 7, entrambi mostrano una buona linearità.

Figura 6. Grafici della curva standard per il gene ASFV e il gene ACT generati utilizzando una miscela di reazione a doppio blocco.

06 Saggio di rilascio dell'attività enzimatica

Utilizzando gli anticorpi a doppia chiusura (Cat#31303) di Yeasen per sigillare l'enzima Taq e sottoponendolo a uno shock termico a 95°C per 20 secondi, è stata rilevata l'attività enzimatica. Si può osservare che dopo uno shock termico di 20 secondi a 95°C, 31303 può rilasciare più del 95% dell'attività enzimatica, il che è paragonabile agli anticorpi della Società T.

Tabella 1. Shock termico a 95°C per 20 secondi dell'enzima.

07 Rilevamento della Taq Polimerasi Multiplex

Gli anticorpi a doppia chiusura di Yeasen (Cat#31303) sono stati utilizzati per sigillare tre tipi di Taq polimerasi (tipo selvatico + due tipi mutanti), con un rapporto di sigillatura di 1μg a 5U, e sono stati misurati i valori di fluorescenza e l'efficienza di sigillatura. È stato scoperto che per diversi tipi di Taq polimerasi, gli anticorpi a doppia chiusura di Yeasen (Cat#31303) hanno mostrato buoni effetti di sigillatura.

Tabella 2. Efficienza bloccata di diversi tipi di Taq polimerasi.