Descrizione
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) è un kit di rilevamento rapido e altamente sensibile basato sul reagente WST-8 (sale monosodico di 2-(2-metossi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disolfofenil)-2H-tetrazolio). WST-8 è un reagente potenziato di MTT e può essere ridotto a un formazano giallo-arancio altamente solubile in acqua dalle deidrogenasi nei mitocondri. La quantità di formazano generata è proporzionale al numero di cellule viventi. Il valore OD del formazano a 450 nm rilevato da un lettore di micropiastre può indicare indirettamente il numero di cellule vitali. Questo kit è ampiamente utilizzato per lo screening di farmaci, i test di proliferazione cellulare e citotossicità, i test di sensibilità ai farmaci tumorali e il rilevamento dell'attività di fattori biologici.
Vantaggi del metodo CCK-8
1. Confronto del metodo CCK-8 con altri metodi di rilevamento della proliferazione/tossicità cellulare.
| Metodo di rilevamento | Metodo MTT | Metodo XTT | Metodo WST - 1 | Metodo CCK 8 |
|---|---|---|---|---|
| Solubilità in acqua del prodotto formazano | Basso (è necessario aggiungere solvente organico per scioglierlo e quindi testarlo) | Alto | Alto | Alto |
| Caratteristiche del prodotto | Polvere | 2 bottiglie di soluzione | Soluzione | 1 flacone di soluzione |
| Modalità d'uso | Mescolare nella soluzione e utilizzare | La soluzione è stata preparata appena prima dell'uso. | Fuori dagli schemi | Fuori dagli schemi |
| Sensibilità di rilevamento | Alto | Molto alto | Molto alto | Alto |
| Rilevamento tempo | Lungo | Corto | Corto | Il più corto |
| Lunghezza d'onda di rilevamento | 560-600 nm | 420-480 nm | 420-480 nm | 430-490 nm |
| citotossicità | Elevata tossicità, scomparsa completa della morfologia cellulare | Bassa tossicità, morfologia cellulare invariata | Basso tossicità, morfologia cellulare invariata | Bassa tossicità, morfologia cellulare invariata |
| Stabilità del reagente | Generale | Basso | Generale | Alto |
| Test di campioni in massa | Fattibile | Appropriato | Appropriato | Appropriato |
2. Il rosso fenolo e il siero non interferiscono con il rilevamento del CCK-8.
3. Poiché la citotossicità del reagente CCK-8 è molto bassa, il tempo di misurazione ottimale può essere determinato eseguendo ripetutamente la lettura con un lettore di micropiastre in momenti diversi dopo l'aggiunta del reagente CCK-8.
Spedizione e stoccaggio
Il prodotto può essere conservato a una temperatura compresa tra -25 e -15 °C in un luogo asciutto e buio per due anni.
Precauzioni
1. Nel primo esperimento, si raccomanda di determinare il numero ottimale di cellule piastrate e il tempo di incubazione ottimale del reagente CCK-8.
2. Se possibile, utilizzare una pipetta multicanale per ridurre le variazioni tra i pozzetti replicati. Evitare bolle nell'esperimento poiché interferirebbero con la lettura OD. Quando si aggiunge il reagente CCK-8, si consiglia di aggiungerlo vicino alla parete della piastra di coltura anziché inserirlo nel mezzo di coltura.
3. I globuli bianchi potrebbero richiedere un tempo di incubazione più lungo.
4. Quando si utilizza una piastra standard a 96 pozzetti, il numero di cellule piastrate è di almeno 1.000 cellule/pozzetto (100 μL). La sensibilità di rilevamento per i globuli bianchi è relativamente bassa, quindi si consiglia di piastrare almeno 2.500 cellule/pozzetto (100 μL). Se si utilizza una piastra a 24 o 6 pozzetti, calcolare il numero corrispondente di cellule per ogni pozzetto e aggiungere il volume appropriato di reagente CCK-8 (il volume di reagente CCK-8 aggiunto è il 10% del volume del terreno di coltura in ogni pozzetto della piastra).
5.Se il filtro da 450 nm non è disponibile, è possibile utilizzare un filtro con assorbanza compresa tra 430 e 490 nm, ma il filtro da 450 nm può raggiungere la massima sensibilità di rilevamento.
6. Il rosso fenolo non influenza la misurazione poiché l'assorbanza del rosso fenolo nel mezzo può essere eliminata sottraendo l'assorbanza del gruppo bianco.
7. Per la vostra sicurezza e salute, indossate il camice da laboratorio e guanti monouso quando eseguite l'esperimento.
Istruzioni
I. Crea una curva standard
1. Preparare la sospensione cellulare, determinare la densità cellulare e quindi piastrare le cellule.
2. Diluire sequenzialmente le cellule con il terreno di coltura secondo un certo rapporto (ad esempio 1:2) per formare un gradiente di concentrazione cellulare, generalmente 3-5 gradienti di concentrazione cellulare, 3-6 pozzetti di replica per ciascuna concentrazione.
3. Dopo aver placcato, coltivare le cellule per 2-4 ore per farle aderire. Quindi, aggiungere il reagente CCK-8, incubare per un certo periodo di tempo e misurare il valore OD. Tracciare una curva standard con il numero di cellule come asse X e il valore OD come asse Y. In base a questa curva standard, è possibile determinare il numero di cellule in un campione sconosciuto (la premessa dell'utilizzo di questa curva standard è che le condizioni sperimentali debbano essere coerenti).
II. Saggio di vitalità cellulare
1. Piastrare le cellule (100 μL/pozzetto) in una piastra da 96 pozzetti. Collocare la piastra in un'incubatrice (37°C, 5% CO2) per un periodo di pre-incubazione.
2. Aggiungere 10 μL di reagente CCK-8 in ciascun pozzetto (fare attenzione a non introdurre bolle nei pozzetti, poiché interferiscono con la lettura dell'OD) e mescolare delicatamente.
3. Collocare la piastra nell'incubatrice e lasciare incubare per 1-4 ore.
4. Misurare l'assorbanza a 450 nm con un lettore di micropiastre.
5. Se il valore OD non viene misurato immediatamente, aggiungere 10 μL di soluzione di HCl 0,1 M o soluzione di SDS 1% w/v a ciascun pozzetto, coprire la piastra e conservarla al riparo dalla luce a temperatura ambiente. Il valore di assorbanza non cambierà entro 24 ore.
III. Saggio di proliferazione cellulare e citotossicità
1. Piastrare le cellule (100 μL/pozzetto) in una piastra da 96 pozzetti. Collocare la piastra in un'incubatrice (37°C, 5% CO2) per 24 ore per la pre-incubazione.
2. Aggiungere alla piastra 10 μL di diverse concentrazioni della sostanza da testare.
3. Collocare la piastra nell'incubatrice e lasciarla incubare per un determinato periodo di tempo (ad esempio 6, 12, 24 o 48 ore).
4. Aggiungere 10 μL di reagente CCK-8 in ciascun pozzetto (fare attenzione a non introdurre bolle nei pozzetti, poiché interferiscono con la lettura dell'OD) e mescolare delicatamente.
5. Collocare la piastra nell'incubatrice e lasciare incubare per 1-4 ore.
6. Misurare l'assorbanza a 450 nm con un lettore di micropiastre.
7. Se il valore OD non viene misurato immediatamente, aggiungere 10 μL di soluzione di HCl 0,1 M o soluzione di SDS 1% w/v a ciascun pozzetto, coprire la piastra e conservarla al riparo dalla luce a temperatura ambiente. Il valore di assorbanza non cambierà entro 24 ore.
Nota: Se la sostanza è ossidante o riducente, sostituire il vecchio terreno di coltura con terreno fresco (rimuovere il vecchio terreno, lavare le cellule due volte con terreno fresco, quindi aggiungere terreno fresco) prima di aggiungere il reagente CCK-8 per eliminare l'effetto della sostanza.Se la sostanza stessa ha solo UN lieve effetto sul valore di assorbanza, non è necessario sostituire il terreno di coltura e l'effetto della sostanza può essere eliminato sottraendo il valore di assorbanza di un gruppo bianco con la sostanza.
Formula di calcolo
Tasso di sopravvivenza cellulare =[(AC) /(BC)] x100%
Tasso di inibizione =[(BA) /(BC)] x100%
A: L'assorbanza del gruppo sperimentale (l'assorbanza del mezzo di coltura contenente cellule, reagente CCK-8 e la sostanza da testare)
B: L'assorbanza del gruppo di controllo (l'assorbanza del mezzo di coltura contenente cellule, reagente CCK-8)
C: L'assorbanza del gruppo bianco (l'assorbanza del mezzo di coltura contenente il reagente CCK-8)
Citazioni
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