Il polibrene (bromuro di esadimetrina), noto anche come polibrene, è un polimero cationico comunemente utilizzato negli esperimenti di trasfezione del DNA con cellule di mammifero per migliorare l'efficienza di trasfezione dei liposomi. È ampiamente impiegato nella trasfezione genica mediata da retrovirus e nella trasfezione genica mediata da lentivirus. Il meccanismo d'azione può comportare la neutralizzazione dell'acido sialico sulla superficie cellulare, facilitando l'adsorbimento superando la repulsione elettrostatica con le particelle virali. Il polibrene è anche riconosciuto come anticoagulante (antagonista dell'eparina) ed è frequentemente utilizzato nella produzione di globuli rossi aggregati in modo non specifico. Inoltre, nel sequenziamento proteico, è stato dimostrato che basse dosi di polibrene migliorano significativamente la degradazione dei peptidi nell'analisi di sequenziamento automatizzata. L'aggiunta di polibrene alle membrane PVDF può anche migliorare l'affinità della membrana.

Specificazione

Il prodotto è fornito in forma di soluzione e la polvere viene ricostituita in NaCl allo 0,9% per ottenere una soluzione da 10 mg/mL, che viene poi sterilizzata utilizzando un filtro da 0,22 μm. Viene solitamente diluito in un rapporto di 1:1000-1:2000 per l'uso, con rapporti di diluizione specifici a seconda del tipo di cellula, come delineato nella letteratura pertinente.

Spedizione e stoccaggio

Si raccomanda il trasporto e lo stoccaggio a -20 ºC, con una durata di conservazione di 2 anni. Si consiglia di aliquotare e conservare per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.

Precauzioni:

1. Per motivi di sicurezza e salute, indossare tute da laboratorio e guanti monouso.

2. Questo prodotto è destinato esclusivamente alla ricerca.

Fasi operative

(per riferimento, le concentrazioni specifiche possono variare, fare riferimento alla letteratura pertinente):

Nota: il polibrene può presentare una significativa tossicità per alcune cellule (ad esempio neuroni terminalmente differenziati, cellule DC) e si raccomanda di effettuare un test di tossicità prima dell'uso iniziale.

Esperimento 1: Infezione retrovirale

1. Preparazione dello stock di retrovirus ricombinante: cellule di coltura contenenti un monostrato di cellule di confezionamento di retrovirus di transfezione in una piastra da 100 mm con 5 mL di terreno di coltura (5% di siero). Dopo 24 ore, rimuovere il terreno di coltura e filtrarlo attraverso un filtro da 0,45 μm.

2. Coltura delle cellule per l'infezione: in una piastra da 100 mm, aggiungere 10 mL di terreno di coltura completo con una densità cellulare di 5×10⁵ per piatto.

3. Infezione virale: dopo 24 ore di coltura cellulare, rimuovere il terreno di coltura completo. Infettare le cellule con 2 mL di supernatante virale contenente Polybrene (concentrazione finale: 5-10 μg/mL) a 37°C per 3-6 ore.

4. Raccogliere le particelle del virus: aggiungere 8 mL di terreno di coltura completo. Dopo 2-3 giorni di coltura, raccogliere il terreno di coltura per ottenere le particelle del virus.

Esperimento 2: Trasfezione

1. Cellule di coltura in mezzo di crescita completo con una densità cellulare di circa il 50%.

2. Dopo 18-24 ore di coltura cellulare, preparare una miscela di DNA-terreno di crescita-Polybrene. Aggiungere il terreno di crescita completo (2 mL per una piastra da 60 mm, 3 mL per una piastra da 100 mm) e preriscaldare a 37°C. Mescolare delicatamente 10 ng~10 µg di plasmide. Aggiungere Polybrene a una concentrazione finale di 5-10 μg/mL. Mescolare delicatamente. Ogni componente deve essere aggiunto nell'ordine specificato.

3. Rimuovere il terreno di coltura e aggiungere la soluzione di DNA-terreno di crescita-Polybrene alle cellule a 37°C per 6-20 ore. Mescolare delicatamente ogni 1,5 ore entro le prime 6 ore di coltura cellulare.

4. Rimuovere la soluzione di Polybrene-DNA-growth medium. Coprire le cellule con soluzione shock DMSO (15% DMSO in 1× HBSS).Agitare delicatamente la piastra di coltura per 10 secondi ogni volta che si aggiunge la soluzione per garantire una distribuzione uniforme. Incubare le cellule a 37°C per 4 minuti.

5. Rimuovere immediatamente la soluzione shock DMSO e lavare delicatamente le cellule due volte con terreno di coltura completo. Per una piastra da 60 mm, lavare con 5 mL di terreno di coltura ogni volta e per una piastra da 100 mm, lavare con 10 mL di terreno di coltura ogni volta.

6. Aggiungere alle cellule un terreno di coltura completo.

7. Espressione proteica: dopo 24-72 ore di coltura, raccogliere le cellule per l'analisi dell'espressione proteica, se necessario.

Selezione delle cellule: dopo 24-72 ore di coltura, in base allo stato delle cellule, passare a un nuovo terreno di selezione e continuare con la selezione delle cellule.