Il reagente di trasfezione PEI 25000 di polietileneimmina linearizzata è un polimero cationico altamente carico che lega facilmente molecole di acido nucleico caricate negativamente, forma un complesso e consente al complesso di entrare nella cellula. Il reagente di trasfezione è un reagente di trasfezione transitorio con bassa citotossicità, elevata efficienza di trasfezione ed elevata efficienza di espressione genica in cellule come HEK293 e CHO. È stato verificato che il reagente di trasfezione PEI lineare è ampiamente applicabile a una varietà di linee cellulari tra cui HEK-293, HEK293T, CHO-K1, COS-1, COS-7, NIH/3T3, Sf9, HepG2 e cellule Hela, ecc. Il reagente è compatibile con terreni contenenti siero e può introdurre efficacemente acidi nucleici nelle cellule.

Specificazione

Spedizione e stoccaggio

Il prodotto viene spedito a temperatura ambiente e la polvere può essere conservata a 2-8ºC per due anni. La soluzione madre viene conservata a 2-8 ºC per 3 mesi.

Attenzione


1) Dopo che la soluzione PEI preparata è stata tolta da -20 ºC e scongelata, può essere conservata in un frigorifero a 4 ºC e non deve essere ricongelata.

2) Per la maggior parte delle cellule, 3,0 μL di reagente di trasfezione PEI per 1 μg di DNA possono raggiungere un'elevata efficienza di trasfezione. Puoi anche provare a usare un volume di 1,5~4 μL di reagente di trasfezione lineare PEI per 1 μg di DNA per l'ottimizzazione.

3) Per la vostra sicurezza e salute, vi preghiamo di indossare un camice da laboratorio, guanti monouso e una cappa aspirante durante il funzionamento.

4) Questo prodotto è destinato esclusivamente alla ricerca scientifica e non all'uso umano.

Preparazione della soluzione madre (1 mg/mL)


1. Materiali

PEI 25000, acqua/acqua per preparazioni iniettabili (WFI) Milli-Q® o acqua di grado biologico simile, acido cloridrico (HCl) 12 mol/L, idrossido di sodio (NaOH) 10 mol/L, filtro sterile sottovuoto monouso in PES da 0,1~0,2 μm, flacone di conservazione sterile in HDPE o polipropilene.

2. Preparare la soluzione madre (1 mg/mL)

1) In un becher di vetro da 1 L, aggiungere 1 g di polvere PEI 25000 a 900 mL di acqua ultrapura Milli-Q® o altra acqua biologica equivalente e mescolare uniformemente su un agitatore magnetico per produrre un piccolo vortice.

2) Aggiungere goccia a goccia acido cloridrico (12 mol/L) mescolando per regolare il pH fino a quando il pH non è < 2,0.

3) Coprire il becher e mescolare per 3 ore fino a completo scioglimento; mantenere il pH < 2,0 per tutta la durata del processo.

【Nota】: Potrebbero esserci piccole particelle fibrose che non possono essere sciolte, il che è un fenomeno normale.

4) Aggiungere goccia a goccia NaOH (10 mol/L) mescolando per regolare il pH fino a raggiungere 6,9 ​​~7,1.

5) Trasferire la soluzione in un cilindro graduato e aggiungere acqua fino a raggiungere 1 L.

6) Filtrare e sterilizzare con un filtro sotto vuoto monouso in PES da 0,1-0,2 µm per ottenere una soluzione madre da 1 mg/mL.

7) Aliquotare secondo necessità e conservare a -20 °C, stabile per 1 anno.

【Nota】: Dopo aver scongelato nuovamente la soluzione di conservazione, questa può essere conservata a 4 °C ed è stabile per 2 settimane, ma non deve essere ricongelata

Procedura di trasfezione (prendendo come esempio una piastra a 6 pozzetti)


1. Inoculazione cellulare: per migliorare l'efficienza della trasfezione, si consiglia di inoculare le cellule un giorno prima della trasfezione e la densità cellulare al momento della trasfezione è preferibilmente del 70%~80%.

2. Preparare il complesso DNA-PEI: preparare il complesso reagente di trasfezione dell'acido nucleico DNA-PEI secondo il seguente sistema:

1) Per ogni pozzetto di cellule, diluire 2 μg di DNA bersaglio con 100 μL di terreno privo di siero e mescolare accuratamente per formare una diluizione del DNA.

[Nota]: Opti-MEM o ddH2O sono consigliati per il diluente senza siero

2) Aggiungere immediatamente 5 μL di reagente di trasfezione PEI 25000 a 100 μL di diluente del DNA, agitare per 10 secondi e mescolare bene.

3) Incubare a temperatura ambiente per 10-25 minuti per formare il complesso reagente di trasfezione dell'acido nucleico cationico DNA-PEI.

3. Cellule transfettate:

1) Durante la formazione del complesso, rimuovere il terreno di coltura cellulare e aggiungere 2 mL di terreno completo fresco e preriscaldato a ciascun pozzetto.

2) Aggiungere 100 μL del complesso DNA-acido nucleico-PEI direttamente alle cellule, agitare la piastra di coltura e mescolare delicatamente.

3) Coltivare in un incubatore a 37°C, 5% di CO2, e l'espressione del transgene può essere rilevata già 7 ore dopo la trasfezione. Determinare autonomamente il tempo di test più adatto.

4. Screening a rotazione costante (facoltativo)

24 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state sottocoltivate in un nuovo terreno di coltura (diluire le cellule più di 10 volte) e incubate durante la notte a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2. Il giorno successivo, è stato aggiunto un farmaco di screening corrispondente al gene di resistenza alla trasfezione. I cloni resistenti ai farmaci possono essere sottoposti a screening in circa 1 o 2 settimane. Durante questo periodo, il terreno di coltura contenente i farmaci di screening deve essere sostituito frequentemente.

Dosaggio di trasfezione per diversi contenitori di coltura cellulare (solo a scopo di riferimento):