Vero Il kit di rilevamento dei residui di DNA delle cellule ospiti viene utilizzato per l'analisi quantitativa dei residui di DNA delle cellule ospiti Vero in campioni intermedi, semilavorati e prodotti finiti di vari prodotti biologici.

Questo kit adotta la sonda fluorescente Taqman e il metodo della reazione a catena della polimerasi (PCR), che ha un limite minimo di rilevamento del livello fg e può rilevare in modo specifico e rapido il DNA residuo delle cellule Vero. Il kit deve essere utilizzato insieme al kit di preparazione del campione di DNA residuo (Cat# 18461ES).

Prodotto Componenti

^*CI: Controllo interno

Spedizione e stoccaggio

1. Spedito su ghiaccio secco e conservato a -20°C per 2 anno

2. Dopo aver ricevuto la merce, controllarla e conservarla immediatamente alla temperatura di conservazione appropriata.

Attenzione

1. Si prega di leggere attentamente questo manuale prima di utilizzare questo reagente; l'esperimento deve essere standardizzato, inclusa la manipolazione del campione, la preparazione del sistema di reazione e l'aggiunta del campione.

2. L'aggiunta di campioni e la preparazione di soluzioni avviene al meglio sul ghiaccio.

3. Assicurarsi che ogni componente sia completamente agitato e centrifugato a bassa velocità prima dell'uso.

4. Per la vostra sicurezza e salute, vi preghiamo di indossare camici da laboratorio e guanti monouso durante il funzionamento.

5. Questo prodotto è destinato ESCLUSIVAMENTE alla ricerca!

Modelli di strumenti applicabili

Includono ma non sono limitati a:

Bio-Rad: Modulo ottico CFX96.

Termo Scientifico: codice fiscale 7500; Studio Quant ABI 5; Passaggio ABI OnePlus.

Utilizzo delle istruzioni

1. Vero Diluizione standard del DNA e preparazione della curva standard

Il Vero Il controllo del DNA è stato diluito in gradiente utilizzando il tampone di diluizione del DNA fornito nel kit, e la concentrazione di diluizione è 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL, 3 fg/μL.

Vedi istruzioni dettagliate qui sotto:

1.1 Scongelare il Vero Controllo del DNA e tampone di diluizione del DNA su ghiaccio. Dopo il completo scongelamento, agitare delicatamente per mescolare e centrifugare a bassa velocità per 10 secondi.

1.2 Togliere sei provette pulite da 1,5 mL, contrassegnate con 3 ng/μL, ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥.

1.3 Aggiungere 90 μL di tampone di diluizione del DNA e 10 μL di Vero Controllo del DNA al 1.Provetta da microcentrifuga da 5 mL etichettata 3 ng/μL e diluire a 3 ng/μL. Mescolare e quindi centrifugare per 10 secondi. Sottoconfezionare lo standard di DNA diluito e conservarlo a breve termine (non più di 3 mesi) a -80°C. Evitare ripetuti congelamenti-scongelamenti.

1.4 Aggiungere 90 μL di tampone di diluizione del DNA in altri provette, quindi seguire la procedura seguente per le diluizioni seriali.

[Note]:

1. Sono necessari tre pozzetti replicati per ogni concentrazione. L'intervallo di rilevamento è 3 fg/μL-300pg/μL E questa gamma può essere ampliata se necessario.

2. Per ridurre il numero di cicli di congelamento-scongelamento ripetuti ed evitare contaminazioni, si consiglia di conservare il controllo del DNA in aliquote a -80°C per la prima volta.

3. Una volta scongelato, il tampone di diluizione del DNA potrebbe conservare a 2-8°C per 7 giorni, se non utilizzato per un lungo periodo, conservare a -20°C.

4. Assicurarsi che il modello sia completamente miscelato, agitare delicatamente il composto per 15 secondi a 1 minuto per ogni diluizione del gradiente.

2. Preparazione del controllo di recupero dell'estrazione (ERC)

Imposta la concentrazione di Vero DNA nell'ERC secondo necessità (il campione ERC è stato preparato con 3 pg/μL di DNA come esempio), come segue:

2.1 Aggiungere 100 μL di campione di prova in una provetta pulita da 1,5 mL, quindi aggiungere 10 μL di 3pg/μL Vero Standard del DNA (③) e mescolare bene, contrassegnato come ERC.

2.2 Eseguire l'estrazione del DNA dal campione ERC insieme ai campioni di prova per preparare l'ERC purificato campione.

3. Preparazione del campione di controllo positivo (PCS) (facoltativo)

Imposta la concentrazione di Vero DNA nella PCS secondo necessità (il PCS è stato preparato con 3 pg/μL di DNA come esempio), come segue:

3.1 Aggiungere 100 μL 3 pg/μL Vero Norma del DNA (③) in una provetta pulita da 1,5 ml, quindi contrassegnata come PCS.

3.2 Eseguire l'estrazione del DNA del PCS insieme ai campioni di prova per preparare il PCS purificato.

4. Negativo Preparazione della soluzione di controllo (NCS)

Impostato il controllo negativo nell'esperimento, i passaggi operativi specifici sono i seguenti:

4.1 Aggiungere 100 μL matrice del campione (o tampone di diluizione del DNA) in una provetta pulita da 1,5 ml, quindi contrassegnata come NCS.

4.2 Eseguire l'estrazione del DNA dal campione NCS insieme ai campioni di prova per preparare il campione NCS purificato.

5. Preparazione senza controllo del modello (NTC)

Imposta il modello no controllo nell'esperimento, le fasi operative specifiche sono le seguenti:

5.1 L'NTC non richiede alcun pretrattamento del campione e può essere configurato nella fase di rilevamento del contenuto di DNA residuo tramite qPCR.

5.2 Il campione NTC in ogni provetta o pozzetto è 20 microlitro Mescolare (ad esempio 16 microlitro Miscela Vero qPCR + 4 μL Miscela di primer e sonda Vero) + 20 μL Tampone di diluizione del DNA. Si consiglia di configurare tre pozzetti replicati.

6. Sistema di reazione PCR

[Note]:

1. Calcolare il volume totale della reazione PCR in base al numero di reazioni: qPCR Mix =(numero di reazioni+2) × (16+4) μL (incluse le perdite di due pozzetti di reazione). Si raccomandano più di tre repliche per ogni campione nell'esperimento.

2. Dopo aver tappato la provetta o sigillato la piastra, centrifugare la provetta o la piastra di reazione a bassa velocità per 10 secondi. Dopo aver agitato e mescolato a sufficienza per 5 secondi, ripetere la centrifuga per raccogliere il liquido dal coperchio o dalla parete sul fondo. Evitare bolle durante l'operazione.

Per la configurazione consigliata della piastra, vedere la tabella seguente:

La disposizione della piastra comprende: 1 NTC (nessun modello controllo), 1 NCS (controllo negativo soluzione), 6 STD (la curva standard di 6 concentrazioni standard), 3 TS (campioni di prova), 3 ERC (controllo di recupero dell'estrazione), 1 PCS (campione di controllo positivo).Tre pozzetti replicati per ogni campione.

7. Linee guida di installazione per uno strumento PCR (metodo in 2 fasi)

Le seguenti istruzioni si applicano solo allo strumento Thermo ABI 7500 qPCR (Versione software 2.0). Se si utilizza uno strumento diverso, fare riferimento alla guida dello strumento applicabile per le linee guida di configurazione.

7.1 Generare un nuovo esperimento, scegliere il modello di quantificazione assoluta o definito dall'utente.

7.2 Nell'interfaccia "Definisci" e nel riquadro "Obiettivi", aggiungi un obiettivo e chiamalo FAM, scegli il reporter come "FAM" e il quencher come "nessuno".

7.3 Nel riquadro 'Campioni', aggiungi a turno tutte le informazioni sui campioni. Quindi seleziona i pozzetti, scegli il target e i campioni di conseguenza. Imposta l'attività di Vero Standard del DNA come standard e assegna i valori 300000, 30000, 3000, 300, 30, 3 (l'unità di concentrazione del DNA in ogni pozzetto è fg/μL) nella colonna Quantità e denominare i pozzetti STD 1, STD 2, STD 3, STD 4, STD 5, STD 6, corrispondentemente. Imposta il compito di NTC come NTC. Imposta NCS, TS, ERC e PC come Sconosciuto, e nominarli in base al layout della Piastra di cui sopra corrispondentemente. Quindi fare clic su Avanti.

7.4 Impostare il programma di amplificazione: impostare il volume di reazione su 40 μL.

8. Analisi dei risultati qPCR

8.1 Il sistema fornirà automaticamente la Soglia nel pannello Amplification Plot di Analysis. La Soglia fornita dal sistema è talvolta troppo vicina alla linea di base, con conseguente grande differenza in Ct tra i pozzetti replicati. È possibile regolare manualmente la Soglia in una posizione appropriata e fare clic su Analyze. Quindi è possibile inizialmente verificare se la curva di amplificazione è normale in Multicomponent Plot.

8.2 Nella scheda Analisi dei risultati, rivedere il grafico della curva standard. Verificare i valori per Pendenza, Intercetta Y, R2 ed Efficienza. Per una curva standard normale, R²>0,99; 90%≤Eff%≤110%.

8.3 Nel 'Visualizza bene il tavolo' riquadro in Analisi, le concentrazioni di ciascun campione sono mostrate in Quantità, l'unità è fg/μL, le unità possono essere convertite in pg/μL o pg/mL nel rapporto di analisi.

Manuali