Il kit di analisi delle specie reattive dell'ossigeno utilizza il reagente permeabile alle cellule 2',7'–diclorofluorescina diacetato (DCFDA) per valutare quantitativamente le specie reattive dell'ossigeno in campioni di cellule vive. Il DCFDA lipofilo non fluorescente attraversa facilmente la membrana cellulare tramite diffusione passiva seguita da deacetilazione. Il prodotto deacilato è una 2',7'-diclorofluoresceina (DCHF) sensibile agli ossidanti. La DCHF viene successivamente ossidata dai ROS per formare DCF. La DCF è altamente fluorescente e viene rilevata tramite spettroscopia di fluorescenza o citometria a flusso con eccitazione/emissione a 480 nm/525 nm. Rosup, una miscela di composti, è un induttore di ROS e può essere utilizzata come controllo positivo.

Componenti del prodotto

Spedizione e stoccaggio

Questo kit viene spedito con una borsa del ghiaccio. Conservare a -20°C senza luce per 1 anno. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti.

Metodo di applicazione

1. Preparazione del reagente
Soluzione DCFH-DA: centrifugare brevemente a bassa velocità prima di aprire. Preparare una soluzione DCFH-DA di lavoro diluendo 10 mM di DCFH-DA in un mezzo privo di siero per ottenere una concentrazione finale di 10 μM.
[Nota]: DCFH-DA può anche essere diluito in terreni senza rosso fenolo. Utilizzare una soluzione DCFH-DA appena preparata, la conservazione a lungo termine di DCFH-DA diluito non è raccomandata. La concentrazione esatta di DCFH-DA richiesta dipenderà dalla linea cellulare utilizzata, ma un intervallo di partenza generale sarebbe 10-50 μM. Per alcune cellule, se la fluorescenza del controllo negativo (senza sonda DCFH-DA) è molto forte, diluire DCFH-DA a 2-5 μM e ridurre il tempo di incubazione in modo appropriato.
Soluzione Rosup: preparare una soluzione di lavoro Rosup 100 µM diluendo la soluzione madre Rosup 100 mM in un terreno privo di siero. In genere, l'incubazione con Rosup a 37 ℃ per 30 min-4 h al buio può aumentare significativamente i ROS.
[Nota]: Il tempo di incubazione di Rosup dipenderà dalla sensibilità della linea cellulare. Ad esempio, 30 min per Hela e 1,5 h per MRC5. Se l'aumento di ROS non viene osservato entro 30 minuti, il tempo di induzione o la concentrazione possono essere opportunamente aumentati. Se ROS aumenta troppo velocemente, il tempo di induzione o la concentrazione possono essere opportunamente ridotti.
Farmaci: preparare il farmaco di interesse in un terreno completo con il 10% di FBS o un'altra soluzione appropriata alla concentrazione desiderata.
2. Protocollo consigliato per le cellule aderenti
a) Preparazione delle cellule: far crescere le cellule aderenti in un terreno di coltura cellulare standard il giorno prima dell'esperimento, in modo che la confluenza cellulare raggiunga il 70% al momento dell'esperimento.
b) Induzione del farmaco: rimuovere il terreno. Ricoprire ogni pozzetto con farmaci diluiti privi di siero precedentemente preparati e incubare per il tempo desiderato a 37°C al buio.
c) (Facoltativo) Controllo positivo: ricoprire il pozzetto del controllo positivo con la soluzione Rosup preparata in precedenza e incubare per il tempo desiderato a 37°C al buio.
[Nota]: Per le cellule con un tempo di stimolazione breve (solitamente entro 2 ore), la sonda può anche essere caricata prima e poi aggiungere Rosup o un farmaco di interesse.
d) Caricamento della sonda ROS: rimuovere tutto il mezzo e lavare le cellule con mezzo privo di siero per 1-2 volte. Ricoprire ogni pozzetto con la soluzione DCFH-DA preparata in precedenza. Incubare a 37℃ per 30 min al buio.
e) Rimuovere il mezzo e lavare le cellule 1-2 volte con un mezzo privo di siero per rimuovere il DCFH-DA libero.
3. Protocollo consigliato per le cellule in sospensione
a) Preparazione delle cellule: far crescere le cellule in sospensione fino a circa 1,5 × 105 cellule per pozzetto il giorno dell'esperimento.
b) Induzione del farmaco: raccogliere le cellule in una provetta conica mediante centrifugazione e risospenderle in una quantità adeguata di farmaci diluiti senza siero precedentemente preparati e incubare per il tempo desiderato a 37°C al buio.
c) (Facoltativo) Controllo positivo: risospendere le cellule di controllo positivo con la soluzione Rosup preparata in precedenza e incubare per il tempo desiderato a 37°C al buio.
d) Caricamento della sonda ROS: raccogliere in una nuova provetta e lavare le cellule mediante centrifugazione due volte in PBS. Risospendere le cellule con la soluzione DCFH-DA preparata in precedenza con densità cellulare a 1×106-2×107/mL. Quindi incubare a 37℃ per 30 min al buio. Capovolgere la provetta ogni 3-5 minuti per garantire il contatto completo tra la sonda e le cellule.
[Nota]: La densità cellulare deve essere regolata in base al metodo di rilevamento successivo. Ad esempio, per la citometria a flusso, il numero di cellule in una singola provetta non deve essere inferiore a 104/mL o superiore a 106/mL.
e) Raccogliere e lavare le cellule mediante centrifugazione due volte con un mezzo privo di siero per rimuovere il DCFH-DA libero.
4. Rilevamento della fluorescenza e analisi dei dati
Microscopia fluorescente Misurazione: eseguire la microscopia di cellule vive con un set di filtri appropriato per la fluoresceina (FITC) utilizzando un microscopio a fluorescenza. Valutare visivamente le cellule per luminosità e confrontarle tra controllo e campioni o utilizzare metodi di analisi delle immagini per confrontare i segnali tra fotografie digitali di cellule.
Misurazione della citometria a flusso: le cellule aderenti devono essere raccolte con tripsina per preparare una sospensione di cellule singole; per le cellule in sospensione, le cellule vengono raccolte direttamente. Idealmente, devono essere analizzate 10.000 cellule per condizione sperimentale. Le cellule non devono essere eccessivamente dense durante l'esperimento (<1 ×106 cellule/mL). Escludere i detriti e isolare la popolazione cellulare di interesse con il gating. Utilizzando l'intensità fluorescente media, determinare il cambiamento di piega tra i campioni di controllo e trattati con Ex/Em = 480/525 nm.
Misurazione della micropiastra fluorescente: misurare la piastra immediatamente su un lettore di piastre fluorescenti a Ex/Em = 480/525 nm in modalità end point in presenza di terreno. Sottrare le letture in bianco da tutte le misurazioni e determinare la variazione di piega dal controllo del test.

Attenzione

1. Lavare le cellule dopo l'incubazione con DCFH-DA per ridurre il rumore di fondo.
2. Si raccomanda di misurare la fluorescenza il prima possibile dopo l'incubazione per evitare possibili errori.
3. Per la vostra sicurezza e salute, vi preghiamo di indossare camici da laboratorio e guanti monouso durante l'operazione.
4. Solo per uso di ricerca!