La puromicina è un antibiotico aminoglicosidico prodotto dalla fermentazione e dal metabolismo dello Streptomyces alboniger, che uccide i batteri Gram-positivi, varie cellule animali e di insetti inibendo la sintesi proteica. In alcuni casi, la puromicina è efficace contro l'Escherichia coli. Il meccanismo è che puromicina è un analogo del terminale 3' delle molecole di aminoil-TrNA, che può legarsi al sito A del ribosoma ed essere incorporato nella catena peptidica estesa. Dopo che la puromicina si lega al sito A, non parteciperà ad alcuna reazione successiva, con conseguente interruzione prematura della sintesi proteica e rilascio di polipeptidi immaturi contenenti puromicina al C-terminale.

Il gene pac trovato nel ceppo produttore di puromicina Streptomyces alboniger codifica una puromicina N-acetiltransferasi (PAC) che conferisce resistenza alla puromicina. Questa proprietà è ora comunemente usata per lo screening di linee cellulari di mammiferi stabilmente transfettate che trasportano plasmidi del gene pac.

L'applicazione generale della puromicina nella selezione di transfezioni cellulari stabili è correlata alle caratteristiche dei vettori lentivirali. La maggior parte dei vettori lentivirali commerciali ora trasporta il gene pac. In alcuni casi specifici, la puromicina può anche essere utilizzata per lo screening della trasformazione di ceppi di E. coli che trasportano il plasmide del gene pac.

Questo prodotto è adatto per la coltura cellulare; la concentrazione di lavoro comune è 1-10 µg/mL.

Inoltre, la società Yeasen fornisce anche la puromicina (cat# 60209ES) in forma di soluzione, che si presenta in uno stato diverso ma ha la stessa funzione.

Caratteristiche

Purezza≥98%

Applicazioni

Adatto per la coltura cellulare

Sceppi cellulari specifici di mammiferi stabilmente transfettati che trasportano plasmidi che trasportano il gene pac

Schermo IL ceppi di E. coli trasformati che trasportano il plasmide del gene pac

Specifiche

Componenti

Spedizione e stoccaggio

IL Puromicina Dicloridrato i prodotti devono essere conservati a -15℃ ~ -25℃ per 2 anni.

Istruzioni

1. Concentrazione di lavoro consigliata

Cellule di mammifero: 1-10 iog/mL, la concentrazione ottimale deve essere determinata mediante la curva di uccisione.

Escherichia coli: il terreno di coltura LB agar è stato utilizzato per lo screening di Escherichia coli stabilmente trasformato con gene pac a una concentrazione di 125 iog/ml.

Nota: Lo screening di ceppi stabili di E. coli mediante puromicina richiede una regolazione precisa del pH.

Concentrazioni consigliate di puromicina cloridrato

2. Metodo di dissoluzione

Sciogliere la puromicina in acqua distillata per preparare una soluzione madre di 50 mg/mL. Dopo la sterilizzazione mediante filtrazione attraverso un 0,22 iom membrana filtrante, aliquotare e conservare a -25 a -15℃In alternativa, può essere sciolto in metanolo per preparare una soluzione di conservazione di 10 mg/mL.

3. Determinazione di puromicina curva di uccisione (prendendo come esempio la trasfezione di shRNA o la trasduzione di lentivirus)

La concentrazione di screening effettiva di puromicina è correlato al tipo di cellula, allo stato di crescita, alla densità cellulare, al metabolismo cellulare e alla posizione del ciclo cellulare. Per selezionare le linee cellulari shRNA che esprimono in modo stabile, è fondamentale determinare la concentrazione minima di puromicina che uccide le cellule non transfettate/trasdotte. Si raccomanda ai clienti che stanno eseguendo esperimenti per la prima volta di stabilire una curva di uccisione adatta al proprio sistema sperimentale.

1) Giorno 1: la piastra da 24 pozzetti viene piastrata a una densità di 5-8×104 cellule/pozzetto, e un numero sufficiente di pozzetti vengono piastrati per i successivi esperimenti di gradiente. Le cellule sono state incubate durante la notte a 37℃.

2) Giorno 2: A) Preparare il terreno di coltura: terreno fresco contenente diverse concentrazioni di puromicina (ad esempio 0-15 iog/mL, almeno 5 gradienti); B) Sostituire il mezzo di screening appena preparato nelle cellule dopo l'incubazione notturna; Quindi le cellule vengono incubate a 37℃.

3) Giorno 4: sostituire con nuovo terreno di selezione e osservare la vitalità cellulare.

4) A seconda dello stato di crescita delle cellule, passare a un nuovo terreno di selezione ogni 2-3 giorni.

5) Le cellule sono state monitorate quotidianamente per osservare il tasso di cellule vitali e determinare la concentrazione più bassa di farmaco efficace per uccidere le cellule non trasfettate o tutte le cellule non trasdotte entro 4-6 giorni dall'inizio dello screening antibiotico.

4. Screening di linee cellulari di mammiferi stabilmente transfettate

Dopo la trasfezione del plasmide contenente il gene pac, le cellule sono state propagate in un mezzo contenente puromicina per selezionare i transfettanti stabili.

1) 48 ore dopo la trasfezione, le cellule (originali o diluite) vengono coltivate in un terreno fresco contenente un'adeguata concentrazione di puromicina.

Nota: gli antibiotici sono più efficaci quando le cellule si dividono attivamente. Se le cellule sono troppo dense, l'efficacia degli antibiotici sarà notevolmente ridotta. È meglio piastrare le cellule a una densità non superiore al 25%.

2) Rimuovere e sostituire il terreno di coltura contenente puromicina ogni 2-3 giorni.

3) I focolai formati dalle cellule vengono valutati 7 giorni dopo lo screening. Le lesioni potrebbero richiedere un'ulteriore settimana o più, a seconda della linea cellulare ospite e dell'efficienza dello screening della trasfezione.

Nota: osservare lo stato di crescita cellulare ogni giorno. Lo screening della puromicina richiede almeno 48 ore e il periodo di screening della concentrazione efficace della puromicina è generalmente di 3-10 giorni.

4) Trasferire e posizionare 5-10 cloni resistenti in una piastra Petri da 35 mm e continuare la coltura con terreno di selezione per 7 giorni. Questa coltura di arricchimento è per preparare un futuro esperimento di citotossicità.

Documenti:

Scheda di sicurezza

60210_Scheda di sicurezza_HB220421_IT.pdf

Manuali

60210_Manuale_HB250114_IT.pdf

Citazioni e riferimenti:

[1] Furge KA. et al., 2001. Soppressione della tumorigenicità e delle metastasi mediate da Ras attraverso l'inibizione della tirosina chinasi del recettore Met. PNAS 98:10722-7.

[2] Díaz J. et al., 2014. Rab5 è necessario nelle cellule tumorali metastatiche per l'attivazione, la migrazione e l'invasione di Rac1 potenziate da Caveolin-1.. J Cell Sci. 127:2401-6.

[3] Rössger K. et al., 2013. Controllo dell'ipertensione basato sulla ricompensa mediante un'interfaccia sintetica cervello-dopamina. PNAS, 110:18150-5.

[4] Kamer I. et al., 2005. Il BID proapoptotico è un effettore ATM nella risposta al danno del DNA Cell. 122:593-603.

[5] Charnaux N. et al., 2005. RANTES (CCL5) induce un rilascio accelerato dipendente da CCR5 di sindecano-1 (CD138) e sindecano-4 dalle cellule HeLa e si forma.

[6] Gao J, Zhao N, Knutson MD, et al. La proteina dell'emocromatosi ereditaria, HFE, inibisce l'assorbimento del ferro tramite la down-regulation di Zip14 nelle cellule HepG2[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(31):21462-8.

[7] Huang J, Dibble CC, Matsuzaki M, et al. Il complesso TSC1-TSC2 è necessario per la corretta attivazione di mTOR2[J]. Biologia molecolare e cellulare, 2008, 28(12):4104-4115.

[8] Nasser MW, Datta J, Nuovo G, et al. Nasser MW, Datta J, Nuovo G, Kutay H, Motiwala T, Majumder S, Wang B, Suster S, Jacob ST, Ghoshal KDown-regulation del micro-RNA-1 (miR-1) nel cancro polmonare. Soppressione della proprietà tumorigenica delle cellule del cancro polmonare e loro sensibilizzazione all'apoptosi indotta da doxorubicina da parte di miR-1. J Biol Chem 283: 33394-33405[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(48):33394-33405.

[9] Paatero AO, Hilkka T, Happonen LJ, et al. Integrazione del batteriofago Mu nel genoma del lievito e dei mammiferi[J]. Ricerca sugli acidi nucleici, 2008, 36(22): e148-e148.

[10] Zhang D, et al. Un percorso cGAS-STING-PERK non canonico facilita il programma traslazionale critico per la senescenza e la fibrosi degli organi. Nat Cell Biol. 2022 maggio;24(5):766-782. doi: 10.1038/s41556-022-00894-z. Epub 2022 maggio 2. PMID: 35501370.

[11] Lu T, et al. CD73 in piccole vescicole extracellulari derivate da HNSCC definisce l'immunosoppressione associata al tumore mediata dai macrofagi nel microambiente. J Extracell Vesicles. 2022 maggio;11(5): e12218. doi: 10.1002/jev2.12218. PMID: 35524455; PMCID: PMC9077142.

[12] Chen S, et al.Identificazione della proteasi 32 specifica dell'ubiquitina come oncogene nel glioblastoma e meccanismi sottostanti. Sci Rep. 2022 Apr 19;12(1):6445. doi: 10.1038/s41598-022-09497-y. PMID: 35440702; PMCID: PMC9018837.

[13] Han L, et al. La proteina 1 associata alla globulina uterina (UGRP1) lega la podoplanina (PDPN) per promuovere un nuovo percorso infiammatorio durante l'infezione da Streptococcus pneumoniae. Clin Transl Med. 2022 giugno;12(6): e850. doi: 10.1002/ctm2.850. PMID: 35652821; PMCID: PMC9161880.

[14] Sun Q, et al. L'asse MORTALIN-Ca2+ guida la resistenza innata al rituximab nel linfoma diffuso a grandi cellule B. Cancer Lett. 2022 1 luglio; 537:215678. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215678. Epub 2022 18 aprile. PMID: 35447282.