Il solfato di G418, noto anche come solfato di Geneticina, è un antibiotico aminoglicosidico e strutturalmente simile alla Gentamicina B1. Interferisce con la sintesi proteica legandosi al ribosoma 80s e bloccando le fasi di allungamento. Il solfato di G418 è tossico sia per le cellule procariotiche che eucariotiche, inclusi batteri, lieviti, cellule di piante superiori e mammiferi, così come protozoi e vermi. Il gene della resistenza (principalmente neo), localizzato nel trasposone Tn601 (903) o Tn5, deriva dai batteri, ma può essere espresso nelle cellule eucariotiche. Il gene della resistenza può essere introdotto nelle cellule tramite tecniche di ricombinazione genica per ottenere la resistenza di G418, che potrebbe essere utilizzata per esaminare e mantenere la coltura di cellule procariotiche o eucariotiche portatrici del gene della resistenza.

Nelle cellule dei mammiferi, neo, codifica l'espressione dell'ammino-glicoside 3' -fosfotransferasi (APH (3') II) dopo l'integrazione nel genoma eucariotico. Questo enzima inattiva l'antibiotico modificando covalentemente la funzione amminica o idrossilica di G418 e inibendo l'interazione antibiotico-ribosoma, dotando la cellula di resistenza a G418. Nello screening di esperimenti di linee cellulari stabili, le curve di uccisione (curve dose-risposta) dovrebbero essere stabilite per determinare la concentrazione minima efficace per uccidere le cellule non resistenti.

Nelle cellule vegetali, la resistenza può essere ottenuta tramite la trasfezione del plasmide resistente al gene nptII. Il gene nptII codifica anche l'aminoglicoside fosfotransferasi, un enzima che inattiva diversi antibiotici, tra cui G418, kanamicina e palomicina.

Caratteristiche

Purezza≥98%

Produzione standardizzata, utilizzando la modalità di produzione di massa in fabbrica

Ampia gamma di applicazioni, che possono essere utilizzate nei campi della biologia molecolare e della ricerca sperimentale biochimica della coltura tissutale

La piattaforma di cooperazione copre l'intero

Per garantire la stabilità della qualità del prodotto, la differenza tra i lotti è controllata entro l'1%

Applicazioni

Screening di linee cellulari stabilmente transfettate

Specifiche

Componenti

Spedizione e stoccaggio

IL Solfato G418 (Geneticina) i prodotti devono essere conservati a -15℃ ~ -25℃ per 3 anni.

Istruzioni

1. Preparazione della soluzione di conservazione G418 (50 mg/mL, concentrazione attiva)

1) Conversione delle unità di attività

La conversione è stata eseguita secondo questa formula: (1000/A0) ×A1=A2

A0: Valore di potenza di G418, che varia da lotto a lotto. Vedere il rapporto di qualità del lotto o l'etichetta sulla bottiglia.

A1: La concentrazione di G418 attivo desiderata.

A2: La concentrazione effettiva di G418.

Ad esempio, se il valore di attività G418 del lotto è 750 U/mg e la concentrazione attiva di G418 è 50 mg/mL, la concentrazione effettiva della polvere da preparare è 1000/750×50 mg/mL=66,67 mg/mL. Se vengono preparati 10 mL di soluzione di conservazione G418 (concentrazione attiva, 50 mg/mL), devono essere pesati 666,7 mg di polvere.

2) Sterilizzazione e conservazione

Pesare la polvere effettivamente ottenuta dalla conversione di cui sopra e aggiungere 10 ml di acqua deionizzata sterile per scioglierla completamente.

Inumidire preventivamente il filtro ad ago da 0,22 μm con 5 mL di acqua deionizzata sterile, quindi sterilizzare la soluzione G418 mediante filtrazione.Dividere in aliquote la soluzione sterilizzata G418 e conservare a -20℃.

Nota: ① Non filtrare la soluzione torbida, poiché la soluzione non si è completamente sciolta, il processo di filtrazione causerà la perdita del farmaco, riducendo l'attività della soluzione finale. ② Si sconsiglia di utilizzare terreni di coltura, soluzioni di fosfato o solventi organici per preparare la soluzione di conservazione.

2. Concentrazione di screening comunemente utilizzata

In generale, inizialmente è richiesta un'alta concentrazione di G418 per lo screening dei transforti e si usa una bassa concentrazione per mantenere la coltura. Le condizioni di crescita, i tipi di cellule e altri fattori ambientali possono influenzare il dosaggio efficace di G418, quindi si raccomanda di determinare la concentrazione di screening ottimale attraverso la curva di uccisione (curva dose-risposta).

In genere, l'intervallo di screening delle cellule di mammifero è 200-2000 μg/mL, delle cellule vegetali: 10-100 μg/mL, delle cellule di lievito: 500-1000 μg/mL.

Dati sperimentali sulla linea cellulare

3. Stabilimento della curva di uccisione

Nota: per effettuare lo screening delle linee cellulari con espressione stabile di proteine ​​target, è necessario determinare la concentrazione minima di antibiotici in grado di uccidere le cellule ospiti non transfettate. Ciò può essere ottenuto stabilendo una curva di uccisione (curva dose-risposta). È necessario selezionare almeno sei concentrazioni. G418 è più attivo quando si trattano cellule mitotiche, quindi le cellule devono essere coltivate per un periodo di tempo prima di aggiungere G418.

1) Giorno 1: le cellule non trasformate vengono posizionate su una piastra di coltura appropriata con una densità cellulare del 20-25% a 37℃ e coltivate durante la notte in CO₂;

Nota: per le cellule che necessitano di una densità maggiore per rilevare la vitalità, è possibile aumentare la quantità di inoculazione.

2) Impostare il gradiente di concentrazione di G418 entro l'intervallo appropriato in base al tipo di cellula. Le cellule di mammifero possono essere impostate a 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL.

3) Giorno 2: rimuovere il vecchio medium e sostituirlo con un medium appena preparato contenente la concentrazione corrispondente di farmaci. Fare tre parallele per ogni concentrazione.

4) Quindi sostituire con nuovo terreno contenente G418 ogni 3-4 giorni.

5) I conteggi delle cellule vive vengono eseguiti a un ciclo fisso (ad esempio, ogni 2 giorni) per determinare la concentrazione appropriata. Scegli la concentrazione minima, che uccide la maggior parte delle cellule entro un numero ideale di giorni (solitamente 7-10 giorni), come concentrazione di lavoro per lo screening delle cellule di trasfezione stabile.

4. Screening di cellule transfettate stabili

1) 48 ore dopo la trasfezione, è stato utilizzato il terreno di coltura G418 contenente la concentrazione appropriata per la sottocoltura (sottocoltura diretta o sottocoltura diluita).

Nota: per ottenere buoni risultati di screening, si consiglia di diluire le cellule non oltre il 25%.

2) Cambiare il terreno di coltura contenente i farmaci ogni 3-4 giorni.

3) Misurare la formazione della colonia cellulare dopo 7 giorni di screening. La formazione della colonia potrebbe richiedere un'altra settimana o più, a seconda del tipo di cellula ospite, della trasfezione e dell'efficacia dello screening.

4) Sono stati selezionati 5-10 cloni resistenti, trasferiti su piastre di coltura cellulare da 35 mm e coltivati ​​con un terreno di coltura contenente il farmaco per 7 giorni.

5) Sostituire con mezzo normale.

Documenti:

Scheda di sicurezza

60220_Scheda di sicurezza_HB220421_IT.pdf

Manuali

60220_Manuale_HB250115_IT.pdf

Cifre

Figura 1.Test di stabilità e convalida della concentrazione efficace di genomicina tra diversi lotti

Ceppo sperimentale: E. coli

G69 e G99 sono due lotti diversi

La concentrazione di utilizzo della genomicina è stata determinata essere rispettivamente di 8 mg/L, 12 mg/L e 16 mg/L, e la concentrazione minima effettiva è stata determinata essere di 16 mg/L, che ha inibito perfettamente la crescita di batteri vari. Le prestazioni dei due lotti sono state coerenti.