L'igromicina B, un antibiotico aminoglicosidico sintetizzato dallo Streptomyces hygroscopicus, inibisce la sintesi proteica interferendo con la traslocazione ribosomiale 70S e inducendo una lettura errata dello stampo di mRNA, uccidendo così procarioti (come i batteri), eucarioti (come lieviti, funghi) ed eucarioti di mammiferi superiori.

I geni di resistenza all'igromicina (hyg o hph) derivati ​​da Escherichia coli codificano l'igromicina B fosfotransferasi, che detossifica l'igromicina B in un prodotto fosforilato non biologicamente attivo, rendendolo un eccellente marcatore selettivo per lo screening e la coltura di cellule procariotiche o eucariotiche trasfettate con successo con geni di resistenza all'igromicina. Inoltre, a causa di diverse modalità di azione, l'igromicina B è spesso utilizzata in combinazione con G418 o Blasticidina S per la selezione di linee cellulari a doppia resistenza. L'igromicina B può anche essere utilizzata come agente antivirale perché penetra selettivamente nelle cellule con maggiore permeabilità della membrana a causa dell'infezione virale e inibisce la traduzione. Può anche agire come repellente per insetti se miscelata con mangimi per animali.

Inoltre, la società Yeasen produce anche Hygromycin B (cat# 60224ES) in soluzione, che si trova in uno stato diverso ma ha la stessa funzione.

Caratteristiche

Produzione standardizzata, utilizzando la modalità di produzione di massa in fabbrica

Applicazioni

Screening di linee cellulari stabilmente transfettate

Specifiche

Componenti

Spedizione e stoccaggio

IL Igromicina B i prodotti devono essere conservati a -15℃ ~ -25℃ per 2 anni.

Istruzioni

1. Preparazione della soluzione madre (50 mg/mL)

Pesare 0,5 g di Igromicina B e aggiungerli a 10 mL di 1×PBS, pH 7,4. Dopo completa dissoluzione, filtrare attraverso una provetta da 0,22 iom filtro per sterilizzare. Aliquotare in piccoli volumi monouso (ad esempio, 1 mL) e conservare a -25/-15℃O 2 A 8℃.

2. Concentrazione di screening comunemente utilizzata

La concentrazione di lavoro dell'igromicina B utilizzata per lo screening dei ceppi di trasferimento stabili deve variare a seconda del tipo di cellula, del mezzo, delle condizioni di crescita e del tasso metabolico cellulare, con concentrazioni raccomandate di 50-1000 iog/mL. Per il primo sistema sperimentale, si raccomanda una curva di uccisione (kill curve), la curva di reattività della dose, per determinare la concentrazione di screening ottimale.

In generale, cellule di mammifero: 50-500 iog/mL; Cellule batteriche/vegetali: 20-200 iog/mL; Funghi: 300-1000 iog/ml.

3. Stabilimento della curva di uccisione

Nota: per selezionare linee cellulari stabili, è necessario determinare la concentrazione minima di antibiotici in grado di uccidere le cellule ospiti non transfettate. Ciò può essere ottenuto stabilendo una curva di uccisione (curva dose-risposta). Devono essere predisposte almeno cinque concentrazioni.

1) Giorno 1: le cellule non trasformate vengono disposte in una piastra di coltura adatta a una densità cellulare del 20-25% e coltivate durante la notte.

Nota: la quantità di cellule da inoculare può essere aumentata per le cellule che necessitano di una densità maggiore per rilevare la vitalità.

2) Impostare il gradiente di concentrazione entro l'intervallo appropriato in base al tipo di cellula.La cellula di mammifero può impostare 50, 100, 250, 500, 750, 1000 iog/mL. Diluire la soluzione di igromicina B 1:10 con acqua deionizzata o tampone PBS a 5 mg/mL. Quindi diluire la soluzione alla concentrazione di lavoro corrispondente secondo la seguente tabella.

3) Giorno 2: sostituire con un mezzo appena preparato contenente la concentrazione corrispondente del farmaco. Preparare tre campioni paralleli per ogni concentrazione.

4) Quindi sostituire ogni 3-4 giorni con nuovo terreno contenente farmaci.

5) Eseguire conteggi di cellule vive a intervalli fissi (ad esempio ogni 2 giorni) per determinare la concentrazione appropriata che inibisce la crescita di cellule non transfettate. Selezionare la concentrazione più bassa che può uccidere la stragrande maggioranza delle cellule entro il numero ideale di giorni (solitamente 7-10 giorni) come concentrazione di lavoro per la selezione stabile del transfettante.

4. Screening di linee cellulari di mammiferi stabilmente transfettate

1) 48 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state sottoposte a subcoltura mediante terreno di coltura contenente igromicina B alla concentrazione appropriata (diretta o diluita).

Nota: gli antibiotici funzionano meglio sulle cellule in divisione attiva. Se le cellule sono troppo dense, l'antibiotico non le ucciderà. Dividere le cellule in modo che non siano più del 25% confluenti.

2) Cambiare il mezzo di setacciatura ogni 3-4 giorni.

3) Misurare la formazione della colonia cellulare dopo 7 giorni di screening. La formazione della colonia potrebbe richiedere un'altra settimana o più, a seconda del tipo di cellula ospite, della trasfezione e dell'efficacia dello screening.

4) Selezionare 5-10 cloni resistenti e trasferirli su piastre di coltura cellulare da 35 mm e coltivarli con un terreno di coltura contenente il farmaco per 7 giorni.

5) Sostituire con terreno fresco senza farmaci per la coltura.

Documenti:

Scheda di sicurezza

60225_Scheda di sicurezza_HB220420_IT.pdf

Manuali

60225_Manuale_HB250115_IT.pdf