Descrizione
L'aureobasidina A, nota anche come AbA, Basifungina, breomicina A, è un antibiotico peptidico estere ciclico isolato dal fungo filamentoso Aureobasidium Pullulans n. R106. Ha una forte capacità antimicotica ed è un inibitore della ceramide sintasi fosforilata da inositolo AUR1. È tossica per il lievito anche a concentrazioni più basse (0,1-0,5 μg/mL). Le specie di funghi sensibili all'Aureobasidina A includono Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans e A. niger. Le specie fungine sensibili includono lievito dentale (Saccharomyces cerevisiae), Schizaccharomyces millet (Schizosaccharomyces pombe), Candida glabrata (Candida glabrata), Aspergillus nest (Aspergillus nidulans) e Aspergillus niger (A. niger.). Il meccanismo d'azione è che l'Aureobasidina A inibisce l'attività dell'inositolo fosforamidite (inositolo fosforilceramide, IPC) sintasi, da cui dipende la crescita fungina, e interferisce con la sintesi degli sfingolipidi, uccidendo ulteriormente il ceppo. Sono stati studiati altri geni che codificano le sintasi IPC, come il gene AUR 1 di Saccharomyces cerevisiae e il gene AURA di A. sinensis, che presenta omologia. L'inibizione di questi geni codificanti rende i ceppi resistenti all'Aureobasidina A, come il gene AUR 1-C.
L'aureobasidina A è altamente adatta come marcatore di selezione di farmaci per lo screening di cloni positivi. La resistenza all'aureobasidina A è anche un reporter ideale negli studi di ibridi singoli e doppi di lievito. Questo prodotto è una soluzione di aureobasidina A disciolta in metanolo con una concentrazione di 1 mg/mL.
Caratteristiche
Purezza≥97%
Produzione standardizzata, utilizzando la modalità di produzione di massa in fabbrica
Applicazioni
Studi sui due ibridi di lievito
Studi su un solo ibrido di lievito
Marcatore di selezione rigorosa del farmaco di lievito
La resistenza all'aureobasidina A è un reporter ideale per gli studi di ibridazione del lievito
Specifiche
| Numero CAS | 127785-64-2 |
| Formula molecolare | C60H92N8Lo11 |
| Peso molecolare | 1101,42 g/mol |
| Aspetto | soluzione liquida |
| Purezza | ≥97% |
| Solubilità | La polvere è solubile in DMSO e metanolo (0.5-10 mg/mL); Insolubile in acqua |
| Struttura |
|
Componenti
| Componenti n. | Nome | 60231ES03 | 60231ES08 | 60231ES10 |
| 60231 | Aureobasidina A(ABA） | 1 mg (1 mg/ml) | 5×1 mg (1 mg/ml) | 10×1 mg (1 mg/ml) |
Spedizione e stoccaggio
IL Aureobasidina A(ABA） i prodotti devono essere conservati a -15℃ ~ -25℃ per 2 anni.
Istruzioni
1. Concentrazione lavorativa
Per la concentrazione specifica, fare riferimento alla letteratura pertinente ed esplorare e ottimizzare in base alle proprie condizioni sperimentali (ad esempio scopo dell'esperimento, tipo di cellula, caratteristiche della coltura, ecc.)
2. Esperimento cellulare (esperimento in vitro)
L'aureobasidina A arresta la crescita delle cellule di lievito sia attraverso l'intossicazione da ceramide che attraverso la privazione di inositolofosforilceramidi essenziali[1].
Sono state sintetizzate triple ripetizioni in tandem di ciascun motivo CArG-box. Tutti i frammenti di DNA sono stati clonati nel vettore Y1H pAbAi (Clontech, Mountain View, USA) utilizzando siti di restrizione adatti. Quindi, ogni costrutto pAbAi assemblato è stato linearizzato con BstbI e trasformato nel ceppo Saccharomyces cerevisiae Y1HGold secondo il Yeast Transformation System 2 Manual (Clontech, Mountain View, USA). I cloni che trasportavano il frammento di DNA desiderato sono stati sottoposti a screening per l'autoattivazione su un mezzo di dropout di uracile sintetico integrato con Aureobasidina A nella concentrazione di 100–900 ng/mL, come indicato (Clontech, Mountain View, USA)[2].
Gli open reading frame (ORF) dei geni SlBES1 sono stati amplificati e legati nel plasmide pGBKT7-GAL4BD. I costrutti di fusione GAL4BD-SlBES1 sono stati ulteriormente trasformati in cellule di lievito Y2H Gold. Il SD/−Per coltivare i trasformanti del lievito sono state utilizzate piastre di terreno Trp.IL un-l'attività galattosidasica dei trasformanti è stata identificata da X-un-gal e l'espressione di AUR1-C è stata esaminata da Aureobasidin A[3].
3. Concentrazioni minime inibitorie di Aureobasidina per vari lieviti
|
| Sottoporre a tensione | Minima concentrazione minima (µg/mL) |
| S.cerevisiae | ATCC9763 (diploide) | 0,2-0,4 |
| SH3328 (aploide) | 0,1 | |
| Lievito di sake (diploide) | 0,1-0,2 | |
| Lievito shochu (diploide) | 0,1 | |
| Lievito di birra (triploide o tetraploide) | 0,1 | |
| Panettiere'lievito (diploide) | 0,2-0,4 | |
| Schizo.pombe | JY-745 (monoploide) | 0,1 |
| C.albicans | Codice articolo: TIMM-0136(diploide） | 0,04 |
| C.tropicaleÈ | TIMM-0324(diploide） | 0,08 |
4. Procedure operative (per il sistema di trasformazione del lievito resistente ad AbA)
1) Aggiungere 0,5 mL di coltura di lievito notturna a 50 mL di terreno YPD (composizione: 1 L di terreno liquido contiene 10 g di estratto di lievito, 20 g di polipeptone, 20 g di D-glucosio; per il terreno solido, aggiungere un ulteriore 2% di agar).
2) Incubare a 30℃ per circa 6 ore, fino a quando l'OD660 è 1-2. Quando si utilizzano diploidi, misurare l'OD660 a 2-4.
3) Centrifugare a 1.000×g per 5 minuti.
4) Risospendere il pellet in 10 mL di Soluzione A (composizione: 100 mM acetato di litio, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA), quindi centrifugare a 1.000×g per 5 minuti.
5) Esospendere il pellet nella soluzione A fino a quando l'OD660 è 150.
6) Aliquotare 100 µL della sospensione cellulare in una provetta e incubare a 30℃ per 1 ora.
7) Aggiungere 5 µg del vettore (DNA circolare o lineare) e 150 µg di DNA trasportatore (riscaldato a 100℃ per 10 minuti e poi raffreddato rapidamente).
Nota: pAUR101 richiede DNA lineare per la trasformazione. L'uso di DNA circolare ridurrà l'efficienza della trasformazione o potrebbe persino fallire. pAUR112 e pAUR123 richiedono DNA plasmidico completo per la trasformazione.
8) Aggiungere 850 µL di Soluzione B (composizione: sciogliere 40 g di Polietilenglicole 4000 in 100 mL di Soluzione A e mescolare bene, preparare fresco prima dell'uso) e mescolare delicatamente.
9) Incubare a 30℃ per 30 minuti, poi a 42℃ per 15 minuti.
10) Lasciare a temperatura ambiente per 10 minuti.
11) Centrifugare a 5.000 giri al minuto per 1 minuto e risospendere il pellet in 5 mL di terreno YPD.
12) Incubare a 30℃ per 6 ore o per tutta la notte.
13) Centrifugare a 5.000-10.000 giri al minuto e risospendere il pellet in 1-10 mL di NaCl allo 0,9%.
14) Distribuire 100 µL della sospensione cellulare su piastre con terreno selettivo YPD (contenenti una certa concentrazione di AbA, a seconda del tipo di ceppo).Incubare a 30℃ per 3-4 giorni fino al completamento della trasformazione.
15) Selezionare i trasformanti positivi e/o determinare l'efficienza di trasformazione (espressa come numero di colonie trasformate per microgrammo di DNA plasmidico).
Documenti:
Scheda di sicurezza
60231_Scheda di sicurezza_HB220420_IT.pdf
Manuali
Cifre
Figura 1. Tabella di crescita della piastra di lievito
Ceppo sperimentale:GS115
Quantità di utilizzo: 0,05 μg/mL,0,1 μg/ml,0,5 μg/ml,1 μg/ml
Trattamento: 3-5 Giornoalle 30℃
La riga superiore è il prodotto yeasen, mentre la riga inferiore è il marchio T*.
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Indagine
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