1 ゲネチコマイシンの作用原理

ゲネトマイシン（ジェネティシン、G418）は、原核細胞および真核細胞の70Sおよび80Sリボソームに結合してペプチド鎖の伸長を阻害し、タンパク質合成を阻害するアミノグリコシド系抗生物質です。このメカニズムは、細菌、酵母、植物、哺乳類細胞などに対して毒性があります。細胞にネオマイシン耐性遺伝子（neo遺伝子など）を導入して組み込むと、遺伝子にコードされたアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH（3）II）がG418を共有結合して不活性化し、G418を含む選択培地で増殖した細胞に耐性を与えます。

分子遺伝学的検査では、G418 は安定したトランスフェクションによく使用されるものの 1 つです。

2 ゲノマイシンの応用

2.1 安定導入細胞株のスクリーニング

• G418 は、タンパク質合成を阻害することで耐性遺伝子 (例: neo 遺伝子) を含む細胞をスクリーニングするために使用されました。耐性遺伝子によってコードされるアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼは G418 を不活性化し、細胞に G418 に対する耐性を与えます。通常、哺乳類細胞のスクリーニング範囲は 200 ～ 2000 μg/mL で、最も一般的に使用される作業濃度は 100 ～ 700 μg/mL です。植物細胞は 10 ～ 100 μg/mL、酵母細胞は 500 ～ 1000 μg/mL ですが、以下は参考として G418 を使用していくつかの細胞タイプに使用される濃度です。

細胞	応用	ゲノマイシンの活性化濃度(μg/mL)	引用文献
ムコール属	a) 成長培地で培養 b) 凍結乾燥細菌で培養	a) 10μg/mL b) 30μg/mL	Hirthら、Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 7356-7360 (1982)。
哺乳類	a) スクリーニング用 b) 成長を維持するため	a) 400 -1000 μg/mL b) 200μg/mL	CanaaniとBerg、Proc. Natl. Acad. Sci.、v. 79、5166-5170（1982）。
植物	a) スクリーニング用 b) 成長を維持するため	a) 25～50μg/mL b) 10μg/mL	ウルシックなど。 ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．生物物理学。解像度Com.、v. 101:3、1031-1037 (1981)。
酵母	a) スクリーニング用 b) 成長を維持するため	a) 500μg/mL b) 125～200μg/mL	ヒメネスとデイヴィス、ネイチャー、v.287、869-871（1980）。
細菌	スクリーニング用	16μg/mL	Waitzら、Antimicrob. Agents Chemother., v. 6:5, 579-581 (1974)。

2.2 遺伝子ノックアウトと遺伝子導入

• 遺伝子ノックアウトでは、G418 は標的遺伝子をノックアウトすることに成功した細胞をスクリーニングするために使用できます。遺伝子導入では、G418 は外来遺伝子を宿主細胞のゲノムに統合することを容易にします。

2.3 細胞培養における耐性選択

• 細胞培養中、G418 は抗生物質に耐性のある細胞をスクリーニングするために使用されます。耐性のある細胞は、多くの場合、特定の耐性遺伝子を持っています。

3 ゲノマイシンに関する関連実験手順

3.1 G418原液（50 mg/mL、有効濃度）の調製

1) 活動単位の変換

式 (1000/A0) × A1 = A2 を使用して変換します。ここで、A0 はバッチによって異なる G418 の効力です。対応するバッチの品質管理レポートまたはボトルのラベルを参照してください。A1 は、調製する G418 の目的の有効濃度です。A2 は、実際に計量する粉末対体積濃度です。

たとえば、G418 のバッチの効力が 750 U/mg で、有効濃度を 50 mg/mL に調製したい場合、調製する実際の粉末濃度は 1000/750 × 50 mg/mL = 66.67 mg/mL になります。

G418 原液（有効濃度 50 mg/mL）10 mL を調製する場合、666.7 mg の粉末が必要です。

• 滅菌と保管

上記の換算で得られた実際の粉末重量に基づき、滅菌脱イオン水 10 mL に加えて完全に溶解します。

まず、0.22 μm シリンジ フィルターを 5 mL の滅菌脱イオン水で湿らせて、水分をすべて除去します。次に、このフィルターを使用して濾過し、滅菌して、1 回の使用分 (例: 1 mL) に小分けし、-20°C で 1 年間安定して保管します。

3.2 キルカーブの確立

1) 1日目: 適切な培養プレートに未形質転換細胞を20～25%の細胞密度で播種し、37°C​​、 _CO2で一晩インキュベートします。

2) 細胞の種類に応じて適切な範囲内で濃度勾配を設定し、少なくとも 6 つの濃度を選択します (G418 は分裂期の細胞に対して最も活性が高いため、G418 を追加する前に細胞を一定期間培養する必要があります)。たとえば、哺乳類細胞の場合は、0、50、100、200、400、800、1000 μg/mL に設定します。

3) 2 日目: 古い培地を取り除き、対応する濃度の薬剤を含む新しく調製した培地と交換します。濃度ごとに 3 回繰り返します。

4) 3～4日ごとに新しい薬剤含有培地と交換します。

5) 一定の間隔 (例: 2 日ごと) で生細胞数をカウントし、トランスフェクトされていない細胞の増殖を防ぐ適切な濃度を決定します。安定したトランスフェクト細胞株のスクリーニングの作業濃度として、理想的な日数 (通常 7 ～ 10 日) 内に大部分の細胞を殺すことができる最低濃度を選択します。

3.3 安定トランスフェクト細胞のスクリーニング

• Yisheng Biotech が提供する G418 Geneticin (60220ES) は、有効性が 720 U/mg 以上、純度が約 98%、バッチ安定性があり、価格は他社の G418 製品の約 3 分の 1 です。
• 薬剤を含むスクリーニング培地は3〜4日ごとに交換されました。
• 細胞クローン (コロニー) の形成は、選択から 7 日後に観察および評価されました。コロニーの形成には、宿主細胞の種類、トランスフェクション、およびスクリーニングの有効性に応じて、1 週間以上かかる場合があります。
• 5～10 個の耐性クローンを選別し、35 mm 細胞培養プレートに移し、さらに薬剤を含むスクリーニング培地で 7 日間維持しました。
• 通常の培地培養を変更した後。

4製品の推奨

Yeasen Biotech が提供する G418 Geneticin ( 60220ES ) は、効能が 720 U/mg 以上、純度が約 98%、バッチ安定性があり、価格は他社の G418 製品の約 3 分の 1 です。

仕様	S*	T*	イェーセン	イェーセンの優位性
含有量（HPLC）	/	/	約98%	高純度
効力（U/mg）	≥720µg/mg	707-721 µg/mg	≥720µg/mg	高い効果
価格($/5g)	約1000	約1000	約200	安っぽさ

5 実験例

大腸菌では、G69とG99は2つの異なるバッチであり、ゲノマイシンの濃度はそれぞれ8 mg/L、12 mg/L、16 mg/Lであり、有効最小濃度は16 mg/Lであり、雑菌の増殖を完全に抑制しました。