図1 AbAの構造式、CAS番号127785-64-2

研究により、Saccharomyces cerevisiae の AUR1 遺伝子と Aspergillus nidulans の AURA 遺伝子は相同であり、どちらも IPC 合成酵素をコードすることがわかっています。したがって、これら 2 つの遺伝子の変異は、変異遺伝子 AUR1-C などの株に強力な AbA 耐性を与える可能性があります。AbA は、陽性クローンをスクリーニングするための薬剤選択マーカーとして非常に適しており、条件の最適化を必要とせず、バックグラウンドが非常に低いです。AbA 耐性は、酵母シングル/ダブルハイブリッド研究の理想的なレポーターでもあり、対応する耐性を持つ酵母ハイブリッドシステムと互換性があります。

酵母シングル/ダブルハイブリッドシステムとは

酵母ツーハイブリッドシステム（酵母ツーハイブリッドアッセイ）は、真核生物の転写制御の特性に基づいて、FieldsとSongらによって作成されました。既知のタンパク質間の相互作用を迅速かつ直接的に分析できるため、抗原抗体相互作用の研究、新しいタンパク質と新しいタンパク質機能の発見、薬物ターゲットのスクリーニング、ゲノムタンパク質連鎖地図の確立に広く使用されています。酵母ツーハイブリッドの原理は、真核生物の転写活性化因子には、DNA結合ドメイン（DNA結合ドメイン、DNA-BD）とDNA転写活性化ドメイン（活性化ドメイン、AD）という2つの異なる構造ドメインが含まれており、互いの機能に影響を与えることなく独立して分離できることです。BDとADだけでは転写応答を活性化できませんが、2つが空間的に十分に近い場合にのみ、完全な転写活性化因子の活性を示し、下流の遺伝子が転写されるようになります。研究対象の 2 つのタンパク質 (タンパク質 X とタンパク質 Y) をそれぞれ BD ドメインと AD ドメインと融合したプラスミドを構築し、同じ酵母細胞で発現させると、2 つのタンパク質間に相互作用がない場合、レポーター遺伝子は転写されません。2 つのタンパク質が相互作用する場合は、BD ドメインと AD ドメインが空間的に近くなるため、レポーター遺伝子が転写されます。

図2 酵母ツーハイブリッドの原理図^[1]

酵母ワンハイブリッド技術は、酵母ツーハイブリッド技術に基づいて開発された核酸-タンパク質相互作用を研究するためのツールであり、既知のDNAと既知のタンパク質との相互作用があるかどうかの識別、標的のシス調節要素またはその他の短いDNA結合部位に結合する新しいタンパク質の単離、相互作用することが証明されているDNA結合部位の正確な位置の特定、タンパク質のDNA結合ドメインの分析など、真核細胞における遺伝子の発現調節の研究に広く使用されています。その基本原理は、最も基本的なプロモーター（最小プロモーター、Pmin）の上流に既知のシス作用要素を構築し、Pminの下流にレポーター遺伝子を接続することです。試験する転写因子をコードするcDNAを酵母ADドメイン発現ベクターと融合し、酵母細胞に導入します。この遺伝子の産物がシス作用要素に結合できる場合、Pminプロモーターを活性化して、レポーター遺伝子を発現させることができます。

図3 酵母ワンハイブリッドの原理図^[2]

酵母シングル/ダブルハイブリッド研究用に、Yeasen は製品60231ES Aureobasidin A (AbA)を提供しています。これは、純度 ≥ 97%、濃度 1 mg/mL のメタノールに溶解した AbA 溶液です。Yeasen は、酵母シングル/ダブルハイブリッド実験で 100～1000 ng/mL の AbA 阻害濃度を推奨しており、具体的な作業濃度は宿主細胞の感受性によって異なります (次の表、さまざまな酵母株に対する AbA の最小阻害濃度 (MIC) を参照してください)。

B菌株		MIC (n g/mL )
S.セレビシエ	ATCC9763 (二倍体)	200-400
	SH3328 (半数体)	100
	清酒酵母（二倍体）	100-200
	焼酎酵母（二倍体）	100
	ビール酵母（三倍体または四倍体）	100
	パン酵母（二倍体）	200-400
スキゾ・ポンベ	JY-745（一倍体）	100
カンジダ・アルビカンス	TIMM-0136 (二倍体)	40
C.トロピカリス	TIMM-0324 (二倍体)	80

応用事例

GmSAGT1遺伝子プロモーター上のGmWRKY31タンパク質の結合部位を調べるために、酵母ワンハイブリッド実験で、AUR1-C遺伝子の上流に位置するウラシルレポーター遺伝子Ura3を含むpBait-AbAiベクターに標的DNA配列を挿入した。対応するプラスミドで酵母を形質転換した後、0.9％NaCl溶液に懸濁し、OD600を0.005に調整した。その後、サンプル100μLを500ng / mL AbAを含むプレートに広げ、倒置して30℃で3〜5日間培養した^[3] 。

図 3 GmWRKY31 タンパク質と、断片 F16、F20、F73、delF16、delF20、または delF73 を含む酵母株との相互作用。

当社の試薬を使用した論文

[1] Shunan Zhang、Yuyi Zhang、Kangning Li、他「イネにおける花成調節因子を介して窒素が開花時期と窒素利用効率を媒介する」Current Biology、第31巻、第4号、2021年、https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.095. (IF: 10.834 )

[2] Jiaying Kuang、Yingchun Xu、Yidan Liu、et al. ハスにおける日陰誘導性開花早期終了のNnSnRK1中心制御ネットワーク、Environmental and Experimental Botany、Volume 221、2024、105725、https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2024.105725。 (IF: 5.7 )

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オーレオバシジンA (AbA)	60231ES03/08/10	1/5×1/10×1mg
ポリミキシンB硫酸塩	60242ES03/10	1/10MU

参照ドキュメント

[1] Paiano A, et al. 相互作用タンパク質を同定するための酵母ツーハイブリッドアッセイ。Curr Protoc Protein Sci. 2019年2月;95(1):e70。

[2] John S, et al. 酵母ワンハイブリッドアッセイ：歴史的および技術的観点。方法。2012年8月;57(4):441-447。

[3] Dong H, et al. Peronospora manshurica感染に対する大豆WRKY TFのトランスクリプトーム解析。Genomics. 2019年12月;111(6):1412-1422。