1行動原理
ハイグロマイシン B は、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスの代謝によって生成されるアミノグリコシド系抗生物質であり、転座を阻害し、80S リボソームの誤読を促進することでタンパク質合成を阻害し、それによって原核細胞と真核細胞を死滅させます。
現在、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む原核細胞または真核細胞のスクリーニングと維持に広く使用されています。
2 アプリケーション
2.1Hph +ベクターを安定的に導入した原核細胞または真核細胞（植物細胞および哺乳類細胞）のスクリーニングと培養の維持大腸菌由来のハイグロマイシン B 耐性遺伝子 (hyg または hph) は、ハイグロマイシン B を生物学的に不活性なリン酸化生成物に変換して解毒するハイグロマイシン B ホスホトランスフェラーゼをコードします。この原理を考慮すると、ハイグロマイシン B は、ハイグロマイシン耐性遺伝子が正常に導入された培養された原核細胞または真核細胞をスクリーニングおよび維持するための非常に有用な選択マーカーです。
2.2 作用機序の違いにより、ハイグロマイシン B は、ジェネティシン G418、ブレオマイシン、ブラストサイジンと組み合わせて使用され、2 つの異なるベクターで安定的にトランスフェクトされた細胞株をスクリーニングすることがよくあります。ハイグロマイシン B は、G418 (カタログ番号 60220ES)、ブレオマイシン (カタログ番号 60257ES)、ブラストシジン (カタログ番号 60218ES) とは作用機序が異なるため、二重選択実験で他の選択抗生物質と組み合わせて使用するのに適しています。
2.3 抗ウイルス剤2.4 駆虫剤として動物の飼料に添加され、動物が飼育されます。
2.5 安定的にトランスフェクトされた細胞のスクリーニング
安定したトランスフェクタントのスクリーニングに使用するハイグロマイシン B の作業濃度は、細胞の種類、培地、成長条件、および細胞代謝率によって異なります。推奨濃度は 50 ～ 1000 μg/mL です。実験システムを初めて使用する場合は、殺菌曲線、つまり用量反応曲線を確立して最適なスクリーニング濃度を決定することをお勧めします。一般に、哺乳類細胞の場合は 50 ～ 500 μg/mL、細菌/植物細胞の場合は 20 ～ 200 μg/mL、真菌の場合は 200 ～ 1000 μg/mL です。
3 プロトコル
3.1保存溶液（50 mg/mL）の調製
ハイグロマイシンB 0.5gを量り、10mLの1×PBS、pH7.4を加えます。完全に溶解した後、0.22μmのフィルターで濾過して滅菌します。滅菌溶液を小分けし、-20℃で保存します。
3.2一般的に使用されるスクリーニング濃度
安定株のスクリーニングに使用するハイグロマイシン B の濃度は、細胞の種類、培地、成長条件、細胞代謝率によって異なります。最適なスクリーニング濃度を初めて決定するには、殺菌曲線 (用量反応曲線) を確立することをお勧めします。一般的に、哺乳類細胞: 50 ～ 500 μg/mL、細菌/植物細胞: 20 ～ 200 μg/mL、真菌: 300 ～ 1000 μg/mL です。
3. 3殺傷曲線の確立
【注意】安定細胞株をスクリーニングするためには、未導入宿主細胞を死滅させることができる抗生物質の最小濃度を決定する必要があります。これは、殺菌曲線（用量反応曲線）を確立することによって達成できます。少なくとも 5 つの濃度を設定する必要があります。
1) 1日目: 未形質転換細胞を適切な培養プレートに20～25%の細胞密度で播種し、一晩培養します。【注意】活力を検出するためにより高い密度を必要とする細胞については、接種細胞量を増やすことができます。
2) 細胞の種類に応じて適切な範囲内で濃度勾配を設定します。哺乳類細胞は、50、100、250、500、750、1000 μg/mL に設定できます。ハイグロマイシン B 溶液を脱イオン水または PBS バッファーで 1:10 に希釈して 5 mg/mL にします。次に、次の表に従って、溶液を対応する作業濃度に希釈します。
|
最終濃度（μg/mL） |
培地量（mL） |
5 mg/mL ハイグロマイシンBの添加量（mL） |
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50 |
9.9 |
0.1 |
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100 |
9.8 |
0.2 |
|
250 |
9.5 |
0.5 |
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500 |
9.0 |
1.0 |
|
750 |
8.5 |
1.5 |
|
1000 |
8.0 |
2.0 |
3) 2 日目: 対応する濃度の薬剤を含む新しく調製した培地と交換します。濃度ごとに 3 つのサンプルを並行して作成します。
4) 3～4日ごとに薬剤を含む新鮮な培地と交換します。
5) 生細胞カウントは固定サイクル（例：2 日ごと）で実行され、トランスフェクトされていない細胞の増殖を防ぐための適切な濃度を決定します。安定した細胞株をスクリーニングするための作業濃度として、理想的な日数（通常 7 ～ 10 日）以内に大部分の細胞を殺す最小濃度を選択します。
3.4安定導入細胞のスクリーニング
1) トランスフェクションの 48 時間後、適切な濃度 (直接または希釈) のハイグロマイシン B を含むスクリーニング培地で細胞を継代培養しました。【注意】抗生物質は活発に分裂している細胞に最もよく作用します。細胞が密集しすぎると、抗生物質は細胞を殺しません。細胞が 25% 以下になるように細胞を分割します。
2) スクリーニング培地を3〜4日ごとに交換します。
3) スクリーニングの 7 日後に細胞コロニー形成を測定します。宿主細胞の種類、トランスフェクション、スクリーニングの有効性に応じて、コロニー形成にはさらに 1 週間以上かかる場合があります。
4) 耐性クローンを5～10個選んで35mm細胞培養プレートに移し、薬剤を含むスクリーニング培地で7日間培養します。
5) 培養のために薬剤を含まない新鮮な培地に交換します。
4 件のプロパティ
ハイグロマイシンBは、特異な臭いを持つ白色から黄褐色の粉末で、水、メタノール、エタノールなどに容易に溶解し、多くの有機酸や無機酸と容易に塩を形成します。
5 製品保管
溶液は2〜8℃で直接保存でき、6か月以上保存できます。
6 注意
1)hph遺伝子を導入した細胞はハイグロマイシン耐性を有し、導入細胞は遺伝子を安定的または一時的に発現する。
2)ハイグロマイシンB耐性遺伝子（hygまたはhph）は、大腸菌に加えて、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスやクレブシエラ・ニューモニエなどの他の菌株でも発見されました。
7 製品の推奨
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製品名 |
猫＃ |
仕様 |
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ハイグロマイシンB（50 mg/mL） |
60224ES03 |
1g（20mL） |
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60224ES10 |
10×1g（20mL） |
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|
ハイグロマイシンB |
60225ES03 |
1グラム |
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60225ES10 |
10グラム |
弊社の試薬を使用した8件の論文
[1] Zhao Q, Zheng K, Ma C, et al. PTPSは区画化されたLTBP1のS-ニトロシル化を促進し、低酸素下で腫瘍の成長を促進する。Mol Cell . 2020;77(1):95-107.e5. doi:10.1016/j .molcel.2019.09.018 (IF:14.548)
[2] Wu LY、Shang GD、Wang FX、et al. 動的クロマチン状態プロファイリングにより、シュート再生におけるオーキシンとサイトカインの調節的役割が明らかになった。Dev Cell . 2022;57(4):526-542.e7. doi:10.1016/ j.devcel.2021.12.019 (IF:12.270)
[3] Zhang TQ、Chen Y、Wang JW。シロイヌナズナの栄養芽細胞の先端の単一細胞解析。Dev Cell . 2021;56(7):1056-1074. e8. doi:10.1016/j.devcel.2021.02.021 (IF:12.270)
[4] Wang FX、Shang GD、Wu LY、Xu ZG、Zhao XY、Wang JW。クロマチンアクセシビリティダイナミクスと植物体細胞胚形成の階層的転写制御ネットワーク構造。Dev Cell。2020 ;54(6):742-757.e8。doi:10.1016/j.devcel.2020.07.003 (IF:10.092)
[5] Zhu GD、Yu J、Sun ZY、et al。ゲノムワイドCRISPR/Cas9スクリーニングにより、神経膠芽腫の放射線耐性に関与するCARHSP1が特定されました。Cell Death Dis。2021 ;12(8):724。2021年7月21日発行。doi:10.1038/s41419-021-04000-3 (IF:8.469)
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[7] Jiang Z、Cui Z、Zhu Z、et al. グルコースからのバイオベースコハク酸の高効率生産のためのYarrowia lipolyticaトランスポーターのエンジニアリング。Biotechnol Biofuels . 2021;14(1):145. 2021年6月27日発行。doi:10.1186/s13068-021-01996-w (IF:6.040)
[8] Liu Y, Jiang X, Cui Z, Wang Z, Qi Q, Hou J. α-ファルネセン生産のための油性酵母Yarrowia lipolyticaの工学的利用。バイオテクノロジーバイオ燃料。2019;12:296。2019年12月23日発行。doi:10.1186/s13068-019-1636-z (IF:5.452)
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[10] Cui Z, Zheng H, Jiang Z, et al. Yarrowia lipolyticaにおける安定発現およびエピソーム発現のためのミトコンドリア複製起点の同定と特性解析。ACS Synth Biol . 2021;10(4):826-835. doi:10.1021 /acssynbio.0c00619 (IF:5.110)
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製品名 |
猫＃ |
仕様 |
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シプロフロキサシン塩酸塩 |
60201ES05/25/60 |
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60203ES10/60 |
10/100g |
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ドキシサイクリン塩酸塩 |
60204ES03/08/25 |
1/5/25g |
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クロラムフェニコール、USPグレード |
60205ES08/25/60 |
5/25/100g |
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カナマイシン硫酸塩 |
60206ES10/60 |
10/100g |
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テトラサイクリン HCl テトラサイクリン塩酸塩 (USP) |
60212ES25/60 |
25/100g |
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塩酸バンコマイシン |
60213ES60/80/90 |
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60214ES03/08/25 |
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スペクチノマイシン塩酸塩 |
60215ES08 |
5g |
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フレオマイシン（溶液中20 mg/mL） |
60217ES20/60 |
20/5×20mg |
|
ブラストサイジンS（ブラストサイジン） |
60218ES10/60 |
10/10×10mg |
|
ナイスタチン |
60219ES08 |
5g |
|
G418硫酸塩（ジェネティシン） |
60220ES03/08 |
1/5g |
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ピューロマイシン（溶液10 mg/mL） |
60209ES10/50/60/76 |
1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 mL |
|
ピューロマイシン二塩酸塩 |
60210ES25/60/72/76/80 |
25/100/250/500mg / 1g |
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ハイグロマイシンB（50 mg/mL） |
60224ES03 |
1g（20mL）/10×1g（20mL） |
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ハイグロマイシンB |
60225ES03/10 |
1/10グラム |
|
エリスロマイシン |
60228ES08/25 |
5/25g |
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ティメンティン |
60230ES07/32 |
3.2/10×3.2g |
|
オーレオバシジンA (AbA) |
60231ES03/08/10 |
1/5×1/10×1mg |
|
ポリミキシンB硫酸塩 |
60242ES03/10 |
1/10MU |