アポトーシスは、一般的に、細胞の発生過程または何らかの要因の作用により、細胞内遺伝子およびその産物の調節を通じて起こる一種のプログラム細胞死を指します。アポトーシスは、胚の発育と形態形成、組織内の正常細胞集団の安定性、身体の防御と免疫反応、病気や中毒による細胞の損傷と老化、腫瘍の発生と進行において重要な役割を果たしており、潜在的な治療的意義を持っています。

アポトーシス経路におけるイベントは時間順に発生し、つまりイベントが順番に発生し、最終的にアポトーシスの発生とともにアポトーシス小体の出現につながります。

その代表的な特徴は以下のとおりです。

1. 初期アポトーシス：細胞膜構造の変化、ホスファチジルセリンの反転；

2. 初期および中期アポトーシス：細胞質密度が増加し、ミトコンドリア膜電位が消失し、透過性が変化し、シトクロムCが細胞質に放出されます。

3. 後期アポトーシス：アポトーシスシグナル伝達

4. 後期アポトーシス：DNAが180〜200bpの断片サイズに分解されます。

図1: アポトーシス経路における連続的なイベントの発生と検出

1. 初期アポトーシス：アネキシンV/PI二重染色（細胞外膜上のPSの検出）

通常の生細胞では、ホスファチジルセリン（PS）は細胞膜の内側にあります。アポトーシスが起こると細胞膜が変化し、PSは細胞膜の内側表面から細胞膜の外側表面に反転します。Annexin-Vは、分子量35-36KDのCa2+依存性リン脂質結合タンパク質であり、PSと高い親和性で結合できます。フルオレセイン（FITC、Alexa fluor488など）で標識されたAnnexin-Vをプローブとして使用し、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡でアポトーシス細胞と生細胞を識別できます。

壊死細胞のPSも細胞膜の内側表面から細胞膜の外側表面へとターンオーバーします。Annexin-Vは壊死細胞表面のPSも認識できるため、Annexin-Vは壊死細胞とアポトーシス細胞を区別できません。また、ヨウ化プロピジン（PI）は核酸染料であり、細胞内のDNAに結合することができますが、細胞膜全体を貫通することはできません。早期アポトーシス細胞と生細胞の細胞膜はまだ無傷であり、PI染料は細胞膜を介して自由に細胞内に進入してDNAと結合できないため、PI染料はアポトーシス細胞と生細胞を標識できませんが、PI染料は壊死細胞の細胞膜を介して細胞内のDNAと結合できます。死細胞内のPI染料は、488nmレーザーで励起された後、赤色蛍光を発し、対応するチャネルで受信されます。したがって、Annexin VとPIを併用することで、生細胞、早期アポトーシス細胞、壊死細胞を区別できます。

図2: アネキシンv/pi二重染色後のフローサイトメトリー結果の分析

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2. 初期アポトーシス：JC-1染色（ミトコンドリア膜電位変化の検出）

アポトーシスのプロセスは、ミトコンドリア膜電位の破壊を伴うことが多く、これはアポトーシスカスケードのプロセスにおける最も初期のイベントの1つであると広く考えられています。これは、核アポトーシスの特徴（クロマチン濃縮、DNA切断）が現れる前に発生します。ミトコンドリア膜電位が崩壊すると、細胞のアポトーシスは不可逆になります。ミトコンドリア膜電位の存在により、ローダミン123、JC-1、JC-10などの一部の親油性カチオン蛍光色素がミトコンドリアマトリックスに結合することができます。それらの蛍光の増加または減少は、ミトコンドリア内膜の電気陰性度の増減を示します。

JC-1は、ミトコンドリア膜電位△ΨMの検出に広く使用されており、ミトコンドリア内で電位依存的に蓄積します。正常なミトコンドリアでは、JC-1はミトコンドリアマトリックス内で凝集してポリマーを形成し、強い赤色蛍光（ex=585 nm、em=590 nm）を発します。アポトーシス細胞では、ミトコンドリア膜電位が脱分極し、JC-1がミトコンドリアから放出され、濃度が低下し、緑色蛍光を発するモノマー形態に戻ります。したがって、色の変化はミトコンドリア膜電位の変化を直接反映します。ミトコンドリアの脱分極の程度は、赤色/緑色蛍光強度の比によっても測定できます。JC-1の検出は一般的な方法です。

3. 後期アポトーシス：TUNEL法（DNA断片in situ標識法）

アポトーシスの後期には、染色体DNAの二本鎖切断または一本鎖切断により、粘着性のある3-OH末端が大量に生成されます。デオキシリボヌクレオチド末端転移酵素（TdT）の作用により、ルシフェラーゼ標識dUTPがDNAの3末端に結合し、アポトーシス細胞を検出できるため、このような方法はターミナルデオキシヌクレオチド転移酵素媒介dUTPニック末端標識（TUNEL）と呼ばれます。正常細胞または増殖細胞ではDNA切断がほとんどないため、3-OH形成がなく、染色できるものはほとんどありません。TUNELは、実際には分子生物学と形態学を組み合わせた研究方法です。完全な単一のアポトーシス核またはアポトーシス小体のin situ染色は、アポトーシスの典型的な生化学的および形態学的特徴を正確に反映できます。パラフィン包埋組織切片、凍結組織切片、培養細胞、組織から分離した細胞の細胞形態を決定するために使用でき、非常に少数のアポトーシス細胞を検出できるため、アポトーシスの研究に広く使用されています。

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