1.樹状細胞（DC）とは何ですか？
樹状細胞（DC）は、人体で最も効果的な抗原提示細胞（APC）です。DCは、ナイーブT細胞の増殖を強力に刺激できる唯一のAPCです。他の種類のAPC（単球、マクロファージ、B細胞など）は、活性化T細胞または記憶T細胞のみを刺激できます。したがって、DC細胞は適応T細胞免疫応答の開始因子であり、腫瘍免疫において極めて重要な役割を果たします。DC細胞は、その表面にMHC-IおよびMHC-II分子を高度に発現し、特定の表面マーカーを持っています。DC細胞はT細胞を取り込み、処理し、刺激して抗原を活性化し、最終的にT細胞の分化方向を決定します。
2. DC のソース
樹状細胞は体内に非常に微量しか存在しません。体内から樹状細胞を直接分離するには長い時間がかかり、細胞の収量も非常に少ないため、樹状細胞の研究と応用は大きく制限されています。しかし、骨髄液中の前駆細胞、末梢血および臍帯血中の単球など、さまざまな組織の樹状細胞前駆細胞から樹状細胞を分化誘導することができます。
ヒトの場合、ヒト末梢血が最も入手しやすく、単球の数も最も多いため、ヒト末梢血単核細胞 (PBMC) から DC を誘導する方法が最も一般的に使用されています。マウスの場合、最も一般的な方法は骨髄細胞、すなわち骨髄由来樹状細胞 (BMDC) から DC を誘導することです。
図1. 従来のBMDC調製法の概略図
3. BMDCの調製方法
マウス BMDC を調製する一般的な方法は次のとおりです。
3.1 古典的なBMDC培養法 - 稲葉法（改良）
3.2 BMDCの大規模調製 - サンズ法
3.3 BMDCの大規模調製 - Lutz法
3.1 [古典的なBMDC培養法] - 稲葉法（改良）
【背景】
a.稲葉法で得られる BMDC の数は 5-7 x 10 6 /マウスです。
b. 元の稲葉法では、BMDC の産生を誘導するために GM-CSF のみを使用しています。得られた BMDC は混合リンパ球反応において強い刺激能力を持っていますが、DC の成熟度は GM-CSF+IL-4 の併用誘導ほど良くありません。そのため、その後の改良法では、GM-CSF+IL-4 の併用誘導がよく使用されます。
【栽培手順】
3.1.1 マウス骨髄細胞の入手
1)マウス（6～10週齢）を頸椎脱臼により殺し、大腿骨と脛骨をすべて外科的に切除し、骨の周囲の筋肉組織をハサミとピンセットで可能な限り除去しました。
【注意】骨を傷つけないように注意して下さい。
2)骨をクリーンベンチに移し、70%アルコールを含む滅菌培養皿に2〜5分間浸して消毒・滅菌し、その後滅菌PBSで2回洗浄します。
3)骨をPBSの入った別の新しい培養皿に移し、骨の両端をハサミで切り、注射器でPBSを抽出します。骨の両端から骨髄腔に針を刺し、骨が完全に白くなるまで繰り返し骨髄を培養皿に流し込みます。
4) 骨髄懸濁液を採取し、200 メッシュのナイロンメッシュで小さな破片と筋肉組織を濾過します。
5)濾液を1200で遠心分離する 5分間rpmで撹拌し、上清を捨てます。
6)塩化アンモニウム赤血球溶解緩衝液（1倍）2mlを加え、細胞を再懸濁し、室温で3〜5分間、最大10分間インキュベートする。 分
7) 溶解バッファーの効果を中和するために 10 ml の PBS を加え、1200 rpm で5 分間遠心分離し、上清を捨てます。
8) PBSで1回洗浄し、10% FBSを含むRPMI1640培地に再懸濁します。マウス骨髄細胞が得られます。
塩化アンモニウム赤血球溶解液の調製：
a. 10倍保存溶液を次のように準備する：82.9を計量する g NH 4 Cl、10.0g KHCO 3、0.37g Na 2 EDTAを1Lの蒸留水に溶解し、0.22で濾過する。 μmフィルター膜で滅菌し、4℃で6ヶ月間保存します。
b.使用前に、10 倍保存溶液を滅菌蒸留水で 1:9 に希釈して 1 倍作業溶液にします。
【注意】塩化アンモニウム赤血球溶解液は骨髄細胞に一定の悪影響を及ぼすため、溶血時間はできる限り短くする必要があります。
3.1.2 BMDC分化の誘導
1) ステップ1で得られたマウス骨髄細胞を数え、 10% FBSを含むRPMI 1640完全培養培地で細胞濃度を0.5～1×10 6 /mlに調整します。
2) 24ウェル培養プレートに細胞を1mlずつ播種し、組み換えマウスGM-CSF（20ng /mL ）とIL-4（ 10ng/mL ）を添加し、37℃、5% CO2インキュベーターで培養する。これが培養0日目である。
【注記】
a.通常、マウス 1 匹から約 4 ～ 5 x 10 7 個の骨髄細胞を採取できるため、24 ウェル プレートの少なくとも 40 ～ 50 個のウェルに播種できます。
b. GM-CSFとIL-4の濃度範囲はそれぞれ20〜50 ng/mLと10〜40 ng/mLです。
3) 培養プレートを2日ごとに軽く振って、3/4の量を新鮮な培養培地に交換し、サイトカインを補充します。
4) 5日目から8日目の間に、培養培地を軽く吹き飛ばして、浮遊細胞と緩く付着した細胞を集めます。
5) 1200で遠心分離 5分間rpmで撹拌し、上清を捨てます。
6) 10% FBSを含むRPMI 1640完全培養培地に細胞を再懸濁して細胞数を数え、細胞濃度を1×10 6 /mlに調整し、組み換えマウスGM-CSF（20 ng/mL ）とIL-4（10 ng/mL ）を加える。
7) 細胞を100mm培養皿（1皿あたり最大10ml）または6ウェル培養プレート（2m/ウェル）に播種します。
8) 37℃、5% CO2インキュベーターで1～2日間培養を続けます。
9) より成熟した BMDC である懸濁細胞を収集します。
【注記】
a.ステップ 2.5 ～ 2.8 は再プレーティング ステップであり、その目的はステップ 2.4 で得られた BMDC をより成熟させることです。
b. 再培養後 3 時間以内に、多数の棘状接着細胞が DC クラスターから遊走しているのが見られ、培養 1 日後には、これらの接着細胞が培養プレートの底から剥がれ、多数の典型的な DC が培養培地中に浮遊しているのが見られます。
3.1.3 BMDCの完全な成熟
[注意] ステップ 2 で得られた BMDC は完全に成熟した DC ではありません。完全に成熟した DC を得るには、LPS、CD40L、または TNF-a による誘導が必要です。
1)ステップ2.4または2.9で得られたBMDCを1200で遠心分離する。 5分間rpmで撹拌し、上清を捨てます。
2) 沈殿物を組換えマウスGM-CSF（20 ng/mL ）およびIL-4（10 ng/mL ）を含むRPMI完全培養培地で再懸濁し、細胞濃度を計数後に1×10 6 /mlに調整する。
3) 24ウェル培養プレートに加え、TNF-α（250 U/mL ）、LPS（1 μg/mL）、またはCD40L（1 μg/mL）。
4) 37℃、5% CO2インキュベーターで2日間培養する。
5) 浮遊細胞と壁に緩く付着して成長する細胞（成熟した樹状細胞）を収集します。
3.2 【 BMDC量産方法】 -Son法
【背景】
a.この方法では、7 日以内にマウス 1 匹あたり 30～40×10 6 個の DC が得られます。これは、稲葉の従来の方法の 7～10 倍です。DC を 14.5% メトリザミド勾配で遠心分離すると、純度 (CD11c+/I-Ab+ 細胞など) は 85～95% に達します。
b. この方法で得られたDCのエンドサイトーシス能力は稲葉古典法よりも弱いですが、分泌されるIL-12p70の量は同様です。
紀元前この方法で得られた DC は、混合リンパ球反応において、稲葉の古典的な方法よりも強い刺激能力を持っています。
d.この方法で得られた DC は、より強力な特異的 T 細胞応答を誘導することができます。
e.要約すると、Son 法では、従来の方法よりもさらに成熟した BMDC を取得できます。
【栽培手順】
3.2.1 マウス骨髄細胞の採取
稲葉メソッド（修正版）の対応する手順を参照してください。
3.2.2 大量のBMDCの調製
1)ステップ1で得られたマウス骨髄細胞を数え、 10% FBSを含むRPMI 1640完全培養培地で細胞濃度を2×10 5 /mlに調整します。
2) 6ウェル培養プレートに5ml/ウェルずつ播種し、組み換えマウスGM-CSF（1000 U/mL ）とIL-4（1000 U/mL ）を加え、37℃、5% CO2インキュベーターで培養する。
3) 培養4日目に、培養系に組み換えマウスGM-CSF（1000 U/mL ）とIL-4（1000 U/mL ）を補充します。
4)培養7日目に樹状細胞を採取し、2～4mLの ml RPMI 1640完全培養培地を等量の14.5% (w/v)メパネマに加え、室温で20分間遠心分離する。 1200xgで最小。
5)中間層を採取し、後で使用するために RPMI 1640 完全培養培地で 3 回洗浄します。
[注記] この時点での DC は未成熟な BMDC です。さらに成熟させたい場合は、手順 3 に進んでください。
3.2.3 BMDCの完全な成熟
1)ステップ2.4で収集したBMDCを再度播種し、組み換えマウスGM-CSF（1000 U/mL ）およびIL-4（1000 U/mL ）、ならびにLPS（1-10 μg/mL ）を培養系に添加する
2) 37℃、5% CO2インキュベーターで2日間培養し、成熟したBMDCsを得た。
3.3 【 BMDCマス調製法】 -Lutz法
【背景】
a. Lutz法はSon法と似ており、どちらの方法でもBMDCを大量に調製できますが、Lutz法の方がSon法よりも広く使用されています。
b.この方法では、より多くの BMDC が得られ、最大 1-3 x 10 8 DC/マウス、純度は 90-95% に達します。
紀元前 この方法で使用されるサイトカイン濃度はSon法よりもはるかに低く、わずか200 U/mLであり、培養8日目から10日目には30〜100 U/mLに低下するため、試薬コストを大幅に節約できます。
d.この方法と稲葉の古典的な方法およびSon法との最大の違いは、骨髄細胞が細胞培養皿ではなく細菌培養皿（ペトリ皿）で培養されることです。稲葉は、細菌培養皿は骨髄中のマクロファージが壁に付着しにくいため、マクロファージの発達が抑制され、マクロファージによるDC成熟の阻害効果が回避されると説明しました。これが、この方法でより低い播種密度で大量のBMDCを得られる主な理由かもしれません。
e. しかし、この方法の培養時間は比較的長く、10〜12日かかります。一方では、より多くのBMDCを得るためです。他方では、ほとんどの顆粒球とリンパ球はこれほど長い時間生存することが難しいため、最終的に得られるBMDCの純度を向上させることができます。
f.この方法では誘導培養に GM-CSF のみを使用し、得られた BMDC には未熟な DC と成熟した DC の両方が含まれます。成熟度をさらに高めるには、LPS または TNF-α を使用してさらに 1 ～ 2 日間誘導する必要があり、成熟した DC 細胞の含有量は 50 ～ 70% に達します。
【栽培手順】
3.3.1 マウス骨髄細胞の採取
稲葉法（修正版）の対応する手順を参照し、溶血手順を省略する必要があることに注意してください。
3.3.2 BMDCの大規模調製
1)ステップ1で得られたマウス骨髄細胞を数え、 10% FBSを含むRPMI 1640完全培養培地で細胞濃度を2×10 5 /mlに調整します。
2) 100mm細菌培養皿（ペトリ皿）に1皿あたり10mlの細胞を撒き、組み換えマウスGM-CSF（200 U/mL ）を加え、37℃、5% CO2インキュベーターで培養します。
[注]ここでは細胞培養プレートではなく細菌培養皿を使用します。
3) 3日目に、20 ng/mLの組み換えマウスGM-CSFを含む完全培養培地10mlを培養皿に加えます。
4) 6日目と8日目に培地の半分を交換します。つまり、古い培地を収集し、遠心分離後に20 ng/mLの組み換えマウスGM-CSFを含む完全培地で細胞ペレットを再懸濁し、細胞懸濁液を元の皿に戻します。
5) 10日目に、BMDCである細胞を採取することができます。
3.3.3 BMDCの完全な成熟
1)培養10日目にDCをピペットで軽く吹き飛ばして浮遊細胞を集め、室温で300xgで5分間遠心分離します。
2)上清を捨て、細胞ペレットを10mlのRPMI 1640完全培養培地で再懸濁し、100mm細胞培養プレートに広げます。
3) 組み換えマウスGM-CSF（100 U/mL ）とTNF-α（500 U/mL ）、または組み換えマウスGM-CSF（100 U/mL ）とLPS（1 μg/mL);
4) 37℃、5% CO2インキュベーターで1～2日間培養を続けます。
4. BMDCの識別
l形態学的観察: ほとんどの BMDC はコロニーで成長し、細胞には複数の樹状突起があり、成熟した BMDC ではそれがより顕著になります。
l細胞表現型分析: フローサイトメトリーを使用して、DC 細胞の表面上の CD11c、CD40、CD80、CD86、MHC クラス II 分子 (IA/IE) の発現を検出しました。BMDC はこれらの分子を高度に発現しており、完全に成熟した BMDC ではこれらの分子の発現がさらに増加します。
l混合リンパ球反応（MLR）：BMDCは刺激能力が強く、成熟度が高いほど刺激能力が強くなります。
5.成熟誘導剤の選び方は？
LPS、CD40L、TNF-αは、ヒトDCとマウスDCの両方に一般的に使用され、効果的な成熟誘導剤です。TNF-αは、3つの中でDC成熟を誘導する能力が最も弱いです。LPSとCD40Lはどちらも、in vitroでのDCの完全成熟の強力な誘導剤です。両方によって誘導されるDCの成熟は似ていますが、誘導されるサイトカインスペクトルは異なります。CD40L誘導成熟BMDCは、保護的および治療的腫瘍免疫応答の生成を含む、in vivoで最も強力な免疫調節能力を示します。LPSでDCの完全成熟を刺激するために使用される濃度は、通常1〜10です。 μg/mLですが、実際には0.1μg/mLでも非常に強い効果がありますが、保険の目的上、1 一般的にはμg/mLが使用されます。CD40L分子はTNFリガンドファミリーに属し、三量体を形成して初めて機能するという特徴があることに注意する必要があります。したがって、DCを刺激するには、組み換えCD40L三量体タンパク質を使用するのが最善であり、効果は良好です。CD40Lモノマーを使用してDCを刺激する場合、成熟度はほとんどの場合それほど高くありません。
6.トレーニング方法の選択
表1. BMDCを調製するための3つの一般的な実験方法の比較
|
パラメータ |
古典的なBMDC培養法 - 稲葉法 |
BMDCの大規模調製 - Son法 |
BMDCの大規模調製 - Lutz法 |
|
PubMedでの引用数 |
783 |
24 |
663 |
|
骨髄溶血、赤血球の溶解 |
はい |
はい |
いいえ |
|
骨髄はまずリンパ球を除去する |
はい |
いいえ |
いいえ |
|
培養中の顆粒球の除去 |
はい |
いいえ |
いいえ |
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骨髄細胞の初期培養量 |
1ml |
15ml |
10ml |
|
インキュベータ |
24ウェル細胞培養プレート |
6ウェル細胞培養プレート |
100mm細菌培養皿 |
|
培養培地 |
RPMI 1640+10%FCS |
||
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マウスGM-CSFの濃度 |
200～1000単位/mL |
添加される最初の濃度は125～1000 U/mLである。 4 日目と 7 日目に、十分な量の GM-CSF と IL-4 を培養システムに追加します。 |
初回添加濃度は200 U/mL。10日目以降は3 ～ 100 U/mL |
|
マウス IL-4 |
必要はない |
必要、濃度はGM-CSFと同じ |
必要はない |
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体液交換法 |
2 日目と 4 日目に、古い培養培地 (細胞を含む) の 50% ～ 75% を廃棄し、十分な GM-CSF を含む新鮮な完全培養培地に交換します。 |
/ |
3 日目には、GM-CSF を含む完全培養培地を同量加えました。6 日目、8 日目、10 日目には、培地の半分を交換しました。古い培養培地 (細胞を含む) を吸引し、遠心分離し、GM-CSF を含む新鮮な完全培養培地に再懸濁してから、戻しました。 |
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継代（拡大）前の培養時間 |
6日間 |
7日間 |
10日間 |
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継代（成熟）後の培養時間 |
2日間 |
なし |
1〜2日 |
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完全成熟誘導剤 |
TNF-ɑ （ 250 U/mL ） |
LPS(1-10 μg/mL) |
TNF-ɑ （ 250 U/mL ）またはLPS（1 μg/mL) |
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DC細胞採取の時期 |
7〜8日 |
7〜8日 |
10～13日 |
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DC 純度 |
8日目： 60-70% |
7日目： 85-95% |
10-12日目： 80-90% |
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DC制作/マウス |
(5-7)×10 6 |
(3-4)×10 7 |
(1-3)×10 8 |
7.推奨される樹状細胞培養試薬
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製品名 |
猫 |
サイズ |
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91108 ES |
5 μg/50 μg/100 μg/500 μg |
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90144ES |
5 μg/50 μg/100 μg/500 μg |
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90621ES |
5 μg/20 μg/50 μg/500 μg |
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94016ES |
25 μg/100 μg/500 μg |