ピューロマイシンは、ストレプトマイセス アルボニガーによって生成されるアミノグリコシド系抗生物質です。これは、アミノアシル tRNA 分子の 3' 末端の類似体であり、リボソームの A 部位に結合して、伸長するペプチド鎖に組み込まれ、リボソーム上のペプチド転座を妨害し、翻訳中に未熟な鎖終結を引き起こし、タンパク質合成を阻害します。
図1 ピューロマイシンの構造式（CAS番号53-79-2）
ピューロマイシン N-アセチルトランスフェラーゼ (pac) をコードする pac 遺伝子は、ピューロマイシン産生細菌 Streptomyces alboniger で発見され、ピューロマイシン耐性を付与しました。この特性は現在、pac 遺伝子を持つプラスミドを持つ哺乳動物の安定したトランスフェクト細胞株のスクリーニングに広く使用されています。安定した細胞株のスクリーニングにおけるピューロマイシンの広範な使用は、レンチウイルスベクターの特性と関連しており、市販のレンチウイルスベクターのほとんどが pac 遺伝子を持っています。特定の特定のケースでは、ピューロマイシンを使用して、pac 遺伝子を持つプラスミドで形質転換された大腸菌株をスクリーニングすることもできます。ピューロマイシンは急速に作用し、低濃度でもすぐに細胞死を引き起こします。付着性哺乳動物細胞は 2～5 µg/mL の濃度のピューロマイシンに敏感ですが、懸濁細胞は 0.5～2 µg/mL の低濃度のピューロマイシンにも敏感です。ピューロマイシンに対する安定した耐性を持つ哺乳類細胞は、1 週間以内に生成できます。
安定細胞株スクリーニング
実験原理
pac 遺伝子を持つベクターに外因性 DNA/shRNA をクローニングすることにより、組み換えベクターが宿主細胞に導入され、その染色体に組み込まれ、細胞分裂によって安定的に伝達され、最後にピューロマイシンでスクリーニングされます。
準備と事前実験
1 推奨使用濃度
哺乳類細胞: 1〜10 μg/mL、最適な濃度は事前の実験によって決定する必要があります。
E.coli: LB 寒天培地上で pac 遺伝子を持つ安定した形質転換 E.coli をスクリーニングするには、125 μg/mL の濃度を使用します。E.coli の安定した形質転換体をピューロマイシンでスクリーニングするには、正確な pH 調整が必要です。
2 溶解方法
ピューロマイシンを蒸留水に溶かして 50 mg/mL のストック溶液を調製し、0.22 μm のフィルターで濾過滅菌し、分注して -20°C で保存します。
3 ピューロマイシンキルカーブの決定（shRNAトランスフェクションまたはレンチウイルストランスダクションを例として使用）
ピューロマイシンの有効なスクリーニング濃度は、細胞の種類、成長状態、細胞密度、細胞代謝、および細胞周期の位置に関係します。トランスフェクトされていない細胞を殺すピューロマイシンの最小濃度を決定することが重要です。最初の実験では、ピューロマイシン勾配スクリーニングの事前実験を実行して、殺菌曲線を確立することが不可欠です。
- 24ウェルプレートに5～8×10 4個/ウェルの密度で細胞を播種し、一晩培養します。
- スクリーニング培地を準備します: 異なる濃度のピューロマイシンを含む新鮮な培地 (例: 0-15 μg/mL、少なくとも 5 つの勾配)。
- 新しく調製したスクリーニング培地に交換し、培養を継続して細胞の成長を観察し、2 ～ 3 日ごとに新しいスクリーニング培地を交換します。
- 毎日細胞の生存を観察します。4 ～ 6 日以内にすべての非トランスフェクト細胞を効果的に殺す薬剤濃度が最小濃度です。
安定トランスフェクタントのスクリーニング
- レンチウイルス感染後 48 ～ 72 時間 (70 ～ 80% のコンフルエンス)、適切な濃度のピューロマイシンを含む培地で細胞を少なくとも 48 時間培養します。ピューロマイシンを含む非トランスフェクト対照群のすべての細胞が死滅すると、ウイルス感染群の残りの細胞はすべて陽性細胞になります。
【注意】：①抗生物質の効果は、細胞が活発な分裂期にあるときに最も顕著になります。細胞が密集しすぎると、抗生物質の効力が大幅に低下します。細胞密度は25％を超えてはなりません。②細胞の増殖状況を毎日観察します。ピューロマイシンスクリーニングには少なくとも48時間かかり、ピューロマイシンスクリーニングの有効濃度は通常3〜10日間続きます。ウイルスのMOIが高いほど、各細胞に含まれるshRNAとピューロマイシン耐性遺伝子のコピーが多くなります。ピューロマイシンスクリーニングを行う際、MOIが高いほど、細胞に含まれるpacコピーが多くなり、細胞が耐えられるピューロマイシンの濃度が高くなります。ピューロマイシンの濃度を調整してトランスフェクトされた細胞をスクリーニングしますが、ピューロマイシンの濃度は、キルカーブの最小有効濃度よりも低くしてはなりません。
- 細胞を増殖させるために、最小濃度のピューロマイシンを含む培養培地を加え、qPCR テストの結果が適格と判断されたら、凍結保存に進みます。
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製品名 |
猫＃ |
仕様 |
外観 |
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ピューロマイシン二塩酸塩 CAS番号:58-58-2 |
60210ES25 |
25mg |
白色から白色に近い粉末 |
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60210ES60 |
100mg |
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60210ES72 |
250mg |
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60210ES76 |
500mg |
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60210ES80 |
1グラム |
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ピューロマイシン （溶液10mg/mL） CAS番号:58-58-2 |
60209ES10 |
1×1mL |
溶液（10 mg/mL水溶液） |
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60209ES50 |
5×1mL |
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60209ES60 |
10×1mL |
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60209ES76 |
50×1mL |
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