Yeasen FuniCut™ シリーズの制限酵素、ユニバーサルバッファーで 5 分間消化
分子クローニングは、ほぼすべての研究室で使用されています。制限エンドヌクレアーゼは分子クローニング実験の重要な要素ですが、制限エンドヌクレアーゼ実験に伴うさまざまな問題に悩まされることもよくあります。一般的な問題は次のとおりです。
- 制限酵素の種類が非常に多いため、選択するのが困難です。
- 誤った切断、ランダムな切断、または不完全な酵素切断。
- 消化速度は遅く、1 時間または一晩かかることもあります。
- さらに、複数の酵素消化実験では、さまざまな酵素消化bToを選択する必要があります。
制限エンドヌクレアーゼをより深く理解していただくために、最初の質問に対する答えとして、制限エンドヌクレアーゼとは何か、そしてさまざまなエンドヌクレアーゼがどのように分類されるかについて、以下で簡単に説明します。
1. 制限エンドヌクレアーゼとは何ですか?
2. 制限エンドヌクレアーゼの命名法
3. エンドヌクレアーゼの分類に関する制限
4.
1. 制限エンドヌクレアーゼとは何ですか?
制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖 DNA 分子内の特定のヌクレオチド配列を認識し、特定の部位の DNA 鎖のホスホジエステル結合を切断できる酵素の一種です。
異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる DNA 配列を認識します。それらは認識配列内または認識配列からそれほど遠くない場所で DNA を切断し、図 1 に示すようにさまざまな生成物を生成します。BamHI は粘着末端を形成し、KpnI は 3' 粘着末端を形成し、EcoRV は平滑末端を形成します。
図1. BamHI、KpnI、EcoRV消化の模式図
2. 制限エンドヌクレアーゼの命名法
制限酵素の命名には、属名、種名、細菌株または血清型、および発見順序が主な要素として使用されます。命名ガイドラインは、BstEII を例として以下の表 1 に示されています。
表1. 制限酵素の命名法
|
略語 |
フルネーム |
含意 |
|
B |
バチルス |
属名の最初の文字 |
|
st |
ステアロサーモフィルス |
種名の最初の2文字 |
|
え |
ET |
菌株名の最初の文字 |
|
Ⅱ |
第二の発見 |
このような細菌に見られる秩序 |
3. エンドヌクレアーゼの分類に関する制限
制限酵素は、構造の複雑さ、作用様式、補因子の違いなどにより、4 つのカテゴリに分類できます。次の表 2 は、各カテゴリの特徴と代表的な酵素をまとめたものです。
表2. 制限酵素の変異
|
エンドヌクレアーゼクラス |
特徴 |
代表的な酵素種 |
|
タイプI |
1. 認識と修飾の切断。 2. 特定の DNA 配列を認識でき、消化部位は認識部位から数千塩基まで無限に離れています。 3. 行動には ATP が必要です。 |
EcoB、EcoKなど |
|
タイプ II |
1. 切断を識別する機能のみを備えています。 2. 認識配列は短い回文配列（約 4～8 bp）であることが多く、制限酵素の特定の消化部位が認識配列となるのが一般的です。 3. 行動にはMg2+が必要である。 4. 分子クローニングで最も頻繁に使用される制限酵素の種類。 |
HindIII、NotIなど |
|
タイプIII |
1. 認識と修正の消化。 2. 認識部位と消化部位を分離します。 3. 行動には ATP が必要です。 |
HinfIII ら |
|
タイプIV |
1. メチル化された DNA 配列のみを切断します。 2. 認識部位と消化部位の間には約 30 bp の間隔があります。 |
McrA、McrBCなど |
下の表 3 に示すように、認識部位と消化部位の類似点と相違点に基づいて 3 つのグループに分けることもできます。
表3. アイソシゾマー、ネオシゾマー、アイソカウダルナーの比較分析
|
アイソシゾマー |
ネオシゾマー |
イソカウダルナー |
|
|
認識シーケンス |
同じ |
同じ |
違う |
|
消化部位 |
同じ |
違う |
同じ |
|
典型的な代表 |
AgeIとBshTI: 両方とも5′-A↓CCGGT-3′を認識して切断する |
SmaI (5'-CCC↓GGG-3') および XmaI(5'-C↓CCGGG-3') |
BamHI (5'-G↓GATCC-3') および BglII (5'-A↓GATCT-3') |
市販されている制限酵素の中には、いまだに一晩の消化を必要とするものがあり、製品が不正確な消化を起こしやすいという事実を考慮して、
4. Yeasen FuniCut™ 高速制限エンドヌクレアーゼ
図2.
4.1 特徴
- 迅速な消化：消化は 5 ～ 15 分で完了し、従来の消化実験と比較して 1 ～ 2 時間以上短縮できます。
- ユニバーサル バッファー: エンドヌクレアーゼの任意の組み合わせで同じバッファーを使用できるため、複数の酵素による切断反応が簡単になります。
- 酵素消化の効果：N* に匹敵し、そのバッファーに適しています。
- 直接電気泳動では、赤色バッファーを提供し、消化産物を直接電気泳動に送ることができるため、プロセスが簡単になります。
- 正確な消化: 一晩消化しても、星の活動はほとんどありません。
4.2 パフォーマンスの展示
4.2.1 FuniCut™ バッファーでは、単一、二重、三重の消化が 5 分で行われます。
図 3. FuniCut ™バッファーを使用した単一、二重、および三重消化は、通常 5 分で完了します (たとえば、EcoRI+KpnI+SmaI を使用した三重消化)。
4.2.2 酵素消化の影響は N* および T* の影響に匹敵し、それらのバッファーでうまく機能します。
図 4. 同様の N*、T* 製品と比較して、
4.2.3 非常に低い星の活動による一晩の消化
図 5.
4.2.4 高度な冗長性があり、ある程度の余剰基質を処理できます。
図 6. FuniCut™ Fast 制限エンドヌクレアーゼ EcoR I、Eag I、XbaI、および Sac I を使用して、それぞれ 1 μg および 1.5 μg のプラスミドを基質として使用し、5 分間消化し、消化産物をアガロースゲル電気泳動にかけました。
表4. 製品と反応緩衝液の適合性
|
製品名 |
猫＃ |
認識シーケンス |
温度 |
熱不活性化温度 |
|
T* バッファ |
N* バッファ |
Ta* バッファー |
保護されたベース (bp) |
回答 |
|
FuniCut™ AscI (お問い合わせ) |
15001ES50 |
GG/CGCGCC |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
1 |
50T |
|
FuniCut™ AvrII (お問い合わせ) |
15002ES25 |
C/CTAGG |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
3 |
25T |
|
FuniCut™ BamHI (お問い合わせ) |
15003ES76 |
G/GATCC |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
3 |
500T |
|
FuniCut™ BclI (お問い合わせ) |
15004ES62 |
T/ガッカ |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
3 |
125T |
|
FuniCut™ BsaI (お問い合わせ) |
15005ES50 |
GGTCTC(1/5) |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
ない |
50T |
|
FuniCut™ BstEII (お問い合わせ) |
15006ES60 |
G/GTNACC |
37 |
80 |
100 |
75 |
100 |
75 |
ない |
100T |
|
FuniCut™ ClaI（お問い合わせ） |
15007ES50 |
AT/CGAT |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
4 |
50T |
|
FuniCut™ DpnII (お問い合わせ) |
15008ES50 |
/ガット |
37 |
80 |
100 |
75 |
100 |
75 |
ない |
50T |
|
FuniCut™ EagI (お問い合わせ) |
15009ES25 |
C/GGCCG |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
2 |
25T |
|
FuniCut™ EcoRI（お問い合わせ） |
15010ES78 |
G/AATTC |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
5 |
600T |
|
FuniCut™ EcoRV (お問い合わせ) |
15011ES70 |
ガット/ATC |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
5 |
200T |
|
FuniCut™ HindIII (お問い合わせください) |
15012ES76 |
A/AGCTT |
37 |
80 |
100 |
75 |
100 |
100 |
3 |
500T |
|
FuniCut™ HpaI (お問い合わせ) |
15013ES50 |
GTT/AAC |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
50 |
1 |
50T |
|
FuniCut™ KpnI (お問い合わせ) |
15015ES70 |
GGTAC/C |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
2 |
200T |
|
FuniCut™ MluI (お問い合わせ) |
15016ES60 |
A/CGCGT |
37 |
80 |
100 |
75 |
100 |
100 |
3 |
100T |
|
FuniCut™ NcoI (お問い合わせ) |
15018ES30 |
C/CATGG |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
3 |
30T |
|
FuniCut™ NdeI（お問い合わせ） |
15019ES70 |
CA/TATG |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
3 |
200T |
|
FuniCut™ NheI（お問い合わせ） |
15020ES30 |
G/CTAGC |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
3 |
30T |
|
FuniCut™ ノットI (お問い合わせ) |
15021ES50 |
GC/GGCCGC |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
2 |
50T |
|
FuniCut™ PstI (お問い合わせ) |
15022ES76 |
CTGCA/G |
37 |
いいえ |
100 |
100 |
100 |
100 |
2 |
500T |
|
FuniCut™ SacI (お問い合わせ) |
15023ES60 |
GAGC/C の |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
3 |
100T |
|
FuniCut™ SalI（お問い合わせ） |
15024ES70 |
G/TCGAC |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
3 |
200T |
|
FuniCut™ SbfI (お問い合わせ) |
15025ES25 |
CCTGCA/GG |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
2 |
25T |
|
FuniCut™ SmaI (お問い合わせ) |
15027ES60 |
CCC/GGG の略。 |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
1 |
100T |
|
FuniCut™ ゲーム (お問い合わせ) |
15028ES50 |
A/CTAGT |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
2 |
50T |
|
FuniCut™ SphI (お問い合わせ) |
15029ES50 |
GCATG/C |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
1 |
50T |
|
FuniCut™ SspI (お問い合わせ) |
15030ES56 |
AAT/ATT |
37 |
80 |
100 |
50 |
100 |
100 |
2 |
60T |
|
FuniCut™ StuI (お問い合わせ) |
15031ES60 |
AG/CCT |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
1 |
100T |
|
FuniCut™ TaqI (お問い合わせ) |
15032ES70 |
T/CGA |
65 |
いいえ |
100 |
100 |
100 |
100 |
4 |
200T |
|
FuniCut™ XbaI (お問い合わせ) |
15033ES76 |
T/CTAGA |
37 |
80 |
100 |
50 |
100 |
100 |
2 |
500T |
|
FuniCut™ XhoI (お問い合わせ) |
15034ES76 |
C/TCGAG |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
4 |
500T |
|
FuniCut™ FspI (お問い合わせ) |
15036ES50 |
TGC/GCA |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
3 |
50T |
|
FuniCut™ ヒンフィ（お問い合わせ） |
15038ES76 |
G/ANTC |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
50 |
2 |
500T |
|
FuniCut™ ApaLI（お問い合わせ） |
15039ES70 |
G/TGCAC |
37 |
80 |
100 |
75 |
100 |
100 |
4 |
200T |
|
FuniCut™ NruI (お問い合わせ) |
15040ES50 |
TCG/CGA |
37 |
いいえ |
100 |
100 |
100 |
100 |
5 |
50T |
|
FuniCut™ PacI (お問い合わせ) |
15041ES25 |
TAAT/TAA |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
2 |
25T |
|
FuniCut™ PvuII (お問い合わせ) |
15042ES70 |
CAG/CTG |
37 |
いいえ |
100 |
100 |
100 |
100 |
4 |
200T |
|
FuniCut™ SacII (お問い合わせ) |
15043ES50 |
CCGC/GG |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
4 |
50T |
|
FuniCut™ NsiI (お問い合わせ) |
15044ES25 |
ATGCA/T |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
3 |
25T |
|
FuniCut™ Esp3I (BsmBI) (お問い合わせ) |
15048ES30 |
CGTCTC(1/5) |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
5 |
30T |
|
FuniCut™ BglII (お問い合わせ) |
15049ES60 |
A/GATCT |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
50 |
2 |
100T |
|
FuniCut™ BstBI (お問い合わせ) |
15050ES60 |
TT/CGAA |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
ない |
100T |
|
FuniCut™ MnlI (お問い合わせ) |
15051ES50 |
国際交流基金(7/6) |
37 |
80 |
100 |
100 |
100 |
100 |
2 |
50T |
CpG: CpG メチル化の影響を受けます。
EK: EcoKI メチル化の影響を受けます。
EB: EcoBI メチル化の影響を受けます。
Dcm: Dcm メチル化の影響を受けます。
Dam: Dam メチル化の影響を受けます。