等温増幅技術は、一定の温度条件下で特定の核酸配列を増幅するという目的を達成できます。特別な装置が不要で、増幅時間が短く、感度が高いという特徴により、オンサイト検出やポイントオブケア診断での優れた応用見通しを示しており、分子診断ツールの開発に非常に適しています。

新型コロナウイルスのパンデミックが株数と感染力の増加を続けている状況において、等温増幅技術は、シンプルな機器で新型コロナウイルスを迅速に検出することができ、従来のPCR技術の長い検出時間と検出機器および試薬に対する高い要件により、一部のCOVID-19患者を迅速に確認できないという問題を解決するのに役立ちます。では、等温増幅技術の1つであるRT-LAMPの原理は何ですか？Yeasenが提供できる高品質の原材料は何ですか？

1. RT-LAMPの原理は何ですか？
2. RT-LAMP用プライマー設計
3. Yeasen はどのような原材料を提供できますか?
4. 製品選択ガイド

1. RT-LAMPの原理は何ですか？

2000年に日本の学者納富らは、ループ介在等温増幅（LAMP）と呼ばれる新しい核酸増幅技術を確立しました。LAMP法は、標的遺伝子の6つの領域に設計された4つの特異的プライマーを使用し、鎖置換DNAポリメラーゼを使用して、等温条件（60〜65℃）下で数十分で標的配列の109コピーを増幅します。結果はアガロースゲル電気泳動で判定され、陽性の結果はラダー状のバンドを示しました。LAMP法は、特異性が強く、感度が高く、操作が迅速かつ簡単で、コストが低いという特徴があります。この技術は継続的に改善され、完成しており、現在、さまざまな病原微生物の検出に使用されています。

RT-LAMP法は、LAMP増幅系に逆転写酵素を加えることで、ウイルスRNAの直接検出を実現する手法です。LAMP法の増幅効率は極めて高いため、少量のcDNAで大量の核酸を増幅することができます。核酸増幅工程における逆転写の時間が節約され、RNAの検出速度が加速されます。

DNAは約65℃で動的平衡状態にあり、鎖置換DNAポリメラーゼの作用により、FIPプライマーのF2セグメントの3'末端から始まり、鋳型DNAの相補配列と対になって鎖置換DNA合成を開始する。F3プライマーはF2cの先端でF3cと相補的であり、3'末端を起点としてそのDNAを合成しながら、鎖置換DNAポリメラーゼの作用により、先頭のFIPプライマーによって合成されたDNA鎖を置き換えながら前方に伸長する。最後のF3プライマーによって合成されたDNA鎖は、1本の鋳型DNA鎖と二重鎖を形成する。FIPプライマーによって合成されたDNA鎖は、F3プライマー鎖に置き換えられて1本鎖を生成する。この1本鎖は、5'末端に相補的なF1cおよびF1セグメントを持つため、自己塩基対合が行われ、環状構造を形成する。そして、BIPプライマーがハイブリダイズして一本鎖と結合し、BIPプライマーの3'末端を起点として相補鎖を合成し、その過程で構造が開かれる。そして、BIPプライマーからF3とB3に類似したプライマーが挿入され、塩基相補対合が行われ、3'末端を起点として新たな相補鎖が合成される。置換された一本鎖DNAの両端には相補配列があり、自己塩基対合が起こり環状構造を形成するため、鎖全体がダンベルのような構造を呈する。この構造がRT-LAMP法の増幅サイクルの開始構造である。

ダンベル型構造では、3'末端のF1セグメントを起点として、それ自体を鋳型としてDNA伸長が行われる。そして、FIPプライマーF2はループ上の一本鎖F2cとハイブリダイズし、新たな一連の鎖置換反応を開始する。F1セグメントから合成された二本鎖核酸は解離し、同様に、核酸上に環状構造が形成される。環状構造上には一本鎖のB2cがあり、BIPプライマー上のB2がこれとハイブリダイズして新たな一連の増幅を開始し、同様のプロセスを経て環状構造が形成される。このプロセスによれば、同じ鎖上の相補的配列は対合、鎖伸長を経て循環し、最終的に異なるサイズの構造を形成する。

2. RT-LAMP用プライマー設計

プライマー設計は、RT-LAMP の増幅と検出を成功させる鍵です。RT-LAMP プライマーには、2 つの外側プライマー (F3 と B3) と 2 つの内側プライマー (FIP と BIP) が含まれます。F3 プライマー: 上流の外側プライマーは F3 領域で構成され、ターゲット遺伝子の F3c 領域に相補的です。FIP プライマー: 上流の内部プライマーは F2 領域で構成され、ターゲット遺伝子の 3' 末端の F2c 領域は、ターゲット遺伝子の 5' 末端の F1c 領域に相補的です。BIP プライマー: 下流の内部プライマーは B2 領域で構成され、B2 領域はターゲット遺伝子の 3' 末端の B2c 領域に相補的で、ターゲット遺伝子の 5' 末端の B1c 領域と同じ配列を持ちます。

PCRと同様に、プライマー設計の原則では、塩基組成、GC含有量、サブ構造などの要素に注意する必要があります。また、次の点にも注意する必要があります。内側プライマーFIPとBIPの5'末端部分、すなわちF1cとB1cの長さは、通常8〜50 bpです。長さは15〜25 bpであることが好ましく、Tm値は3'末端部分のF2とB2のTm値よりも大きいです。内側プライマーFIPとBIPの3'末端部分、すなわちF2とB2の長さは、通常8〜50 bpです。長さは15〜25bpであることが好ましく、Tm値は実験で選択したBst DNAポリメラーゼの最適温度と一致しています。外側プライマーF3とB3の長さは、通常8〜50 bpです。長さは15〜25 bpであることが好ましく、Tm値はF2とB2よりも小さいです。プライマーを設計する際には、ループ構造とターゲット配列のサイズを考慮する必要があります。ループ内の塩基数が 40bp を超え、ターゲット配列のサイズが 130～200bp の場合、増幅効率が最も高くなります。

3. Yeasen はどのような原材料を提供できますか?

3.1 [新アップグレード] Yeasen Bst Plus DNAポリメラーゼ

新しくアップグレードされたHieff™ Bst Plus DNAポリメラーゼ（カタログ番号14402ES、14403ES）は、5′→3′エキソヌクレアーゼドメインを欠くBacillus stearothermophilus sp.のDNAポリメラーゼ遺伝子を大腸菌で発現および精製することによって得られます。酵素鎖置換能力が強く、高感度、高増幅効率、高dUTP耐性などの利点があり、等温増幅技術に基づく病原体のリアルタイム検出に広く使用できます。

3.1.1 高速かつ高感度

Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA ポリメラーゼは感度が高く、5 コピーという低いターゲット遺伝子も検出できます。テンプレートの量はフェムトグラム (fg) レベルで、増幅速度は競合製品よりも高速です。

図 1. SARS-CoV-2 を増幅するために、Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA ポリメラーゼ (オレンジ) と競合他社 N (グレー) および競合他社 T (青) の Bst 酵素を使用して RT-LAMP 反応を実行しました。結果は、Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA ポリメラーゼが競合製品よりも常に速く閾値に到達でき、増幅速度が速いことを示しています。

 

4. 製品選択ガイド

Yeasenが提供する製品は次のとおりです。

表1. 製品情報