非特異的増幅の低減に役立つダブルブロック抗Taq DNAポリメラーゼ抗体

分子診断は体外診断の分野で最も急速に発展している分野です。検出時間が短く、感度が高く、特異性が強いという利点があり、腫瘍の同時診断や感染症や遺伝性疾患のスクリーニングに広く使用されています。分子診断の分野では、PCRは最も成熟した技術プラットフォームであり、最大の市場シェアを誇るだけでなく、臨床診断の「ゴールドスタンダード」技術でもあります。従来のPCR反応では、非特異的増幅の問題が頻繁に発生します。非特異的増幅は検出結果の解釈に直接影響し、増幅感度の低下、さらには標的断片の収量の低下につながります。非特異的増幅はどのようにして発生し、どのように効果的に回避できますか？

1. 従来のDNAポリメラーゼは非特異的増幅を引き起こす可能性がある

2. ホットスタートポリメラーゼは増幅特異性を向上させることができる

3. ダブルブロックTaq抗体は増幅特異性と安定性を2倍に向上させることができる

4. イェーセンのダブルブロックTaq抗体の性能表示

5. 製品情報

1. 従来のDNAポリメラーゼは非特異的増幅を引き起こす可能性がある

プライマーの配列特異性の低さは、非特異的増幅の直接的な原因です。従来の DNA ポリメラーゼのプロモーターとして、そのエキソヌクレアーゼ活性は、PCR システムの準備中に DNA プライマー配列を切り捨て、プライマーの特異性を低下させる可能性があります。

さらに、従来の DNA ポリメラーゼはエキソヌクレアーゼ活性だけでなく、ポリメラーゼ活性も持っています。DNA ポリメラーゼの最適な伸長温度は 72℃ ですが、ポリメラーゼは室温でも活性です。そのため、PCR 反応の準備中および最初の加熱プロセス中に、プライマーが一部の一本鎖テンプレートと非特異的結合を形成し、Taq DNA ポリメラーゼの作用下で伸長し、非標的配列が増幅され、反応の特異性に影響を与える可能性があります。

そのため、PCR システムは氷上で構成され、DNA ポリメラーゼの活性を阻害することがよくあります。この方法は簡単で安価ですが、酵素の活性を完全に阻害することはできないため、非特異的産物の増幅を排除することはできません。

2. ホットスタートポリメラーゼは増幅特異性を向上させることができる

ホットスタートポリメラーゼは、ホットスタートPCRのコアコンポーネントです。室温では、DNAポリメラーゼの活性部位は酵素修飾子によってブロックされています。95℃でPCRを変性させた後にのみ、酵素修飾子が脱落し、酵素活性が開始され、酵素による非特異的増幅を回避します。

現在、市場で一般的に使用されているDNAポリメラーゼのホットスタート修飾法には、主に化学的方法、リガンド法、抗体法があります。その中で、抗体修飾ホットスタートポリメラーゼの阻害効果は最も優れており、酵素活性の放出速度が速く、PCRの反応時間を大幅に短縮できます。これはIVD市場で広く使用されているホットスタート酵素修飾法です。

ただし、従来の抗体ホットスタート法では、Taq DNAポリメラーゼの5'→3'ポリメラーゼ活性のみをブロックするため、低温でのミスマッチやプライマーダイマーによる非特異的増幅しか防止できないことに注意してください。しかし、前述のように、Taq DNAポリメラーゼは5'→3'ポリメラーゼ活性だけでなく、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性も持っています。このエキソヌクレアーゼ活性により、低温でミスマッチプローブやその他の材料が分解され、非特異的なシグナルが発生する可能性があります。

3. ダブルブロックTaq抗体は増幅特異性と安定性を2倍に向上させることができる

国内の分子酵素業界の革新リーダーとして、Yeasen Biotechnology（上海）Co.、Ltd.（以下、Yeasen）は分子酵素原料の研究開発と生産に注力し、革新を敢行しています。 独自の成熟した抗体スクリーニングプラットフォームに依存して、Taq DNAポリメラーゼをターゲット分子としてブロッキング抗体をスクリーニングします。 長年の苦労を重ねた研究とシステムの最適化を経て、 ダブルブロック抗Taq DNAポリメラーゼ抗体を開発しました。これは、Taq DNAポリメラーゼのポリメラーゼ活性をブロックできるだけでなく、Taq DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性もブロックできます。 2つのアプローチで、ミスマッチやプライマーダイマーによる非特異的増幅を効果的に防ぐだけでなく、材料の劣化による非特異的シグナルの発生を防ぎ、試薬の安定性を2倍に向上させます。

4. イェーセンのダブルブロックTaq抗体の性能表示

4.1 ダブルブロックTaq抗体の使用は正確で感度が高い

Yeasenの二重ブロック抗体とT社の抗体でTaqポリメラーゼをブロックした後、ARMS-PCRによって陽性サンプルが検出されました。

図1. ARMS-PCR増幅曲線。青：T社のブロッキング抗体。赤：Yeasenのダブルブロック抗体

図 1 からわかるように、Yeasen の二重ブロック抗体によってブロックされた Taq ポリメラーゼは、ARMS-PCR 増幅において正確なタイピングと高い感度を備えています。

4.2 ダブルブロックTaq抗体はTaq DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を効果的に阻害した

合成されたプライマープローブは、それぞれ非閉鎖型および二重にブロックされた抗体でブロックされた Taq DNA ポリメラーゼの反応溶液と一致し、40℃ で反応して蛍光シグナルを検出しました。

図2. エキソヌクレアーゼ活性に対する二重ブロック抗体の阻害効率の検出。黄色：閉じられていないTaq DNAポリメラーゼグループ。紫色：二重ブロック抗体によってブロックされたTaq DNAポリメラーゼグループ

図 2 から、ダブルブロック抗体が Taq DNA ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を効果的にブロックできることがわかります。

4.3 ダブルブロックTaq抗体は検出試薬の安定性を効果的に向上させることができる

Taq DNAポリメラーゼを、それぞれ従来のブロッキング抗体とダブルブロック抗体でブロックし、プライマープローブを含むフルプレミックスに構成しました。10000コピーのASFプラスミドを4℃で10日間、または37℃で1、3、5日間増幅しました。増幅曲線とCt値の変化を観察し、従来のブロッキング抗体とダブルブロック抗体がフルプレミックス反応溶液の安定性に与える影響を比較しました。

図3. 従来のブロッキング抗体（a）と二重ブロック抗体（b）ブロッキング反応溶液で増幅されたASFプラスミド10000コピーの増幅曲線。青：4℃で10日間保存。赤：4℃で0日間保存（コントロール）

図3から、ダブルブロック抗体は従来のブロッキング抗体よりも反応溶液の安定性を維持し、検出試薬の安定性を効果的に向上させることができることがわかります。プライマープローブを含むプレミックス全体をダブルブロック抗体でブロックし、4℃で10日間置いた後も、増幅曲線とCt値に大きな変化はありませんでした。

図4. 従来のブロッキング抗体（a）と二重ブロック抗体（b）ブロッキング反応溶液で増幅されたASFプラスミド10000コピーの増幅曲線。青：37℃で5日間保存。緑：37℃で3日間。黄色：37℃で1日間。赤：37℃で0日間保存（コントロール）

図4から、ダブルブロック抗体は従来のブロッキング抗体よりも反応溶液の安定性を維持し、検出試薬の安定性を効果的に向上させることができることがわかります。ダブルブロック抗体はプライマープローブを含むプレミックス全体をブロックし、37℃で1、3、5日間置いた後のCt値の差は0.2未満です。

4.4 ダブルブロックTaq抗体はベースラインドリフトの問題を解決するのに役立つ

一部のプライマーが特定のバッファーおよび機器と連携すると、ベースラインのドリフトが発生します。Yeasen 氏は、ベースラインの問題を改善するためにさまざまな方法を試し、ダブルブロック抗体の方が安定したベースラインにつながることを発見しました。

図5. N遺伝子（a）とACT遺伝子（b）の増幅曲線。赤：従来のブロッキング抗体。緑：二重ブロック抗体

図 5 からわかるように、特定のプライマーとバッファーの下で二重ブロック抗体を使用すると、ベースライン ドリフトの問題を解決するのに役立ちます。

4.5 ダブルブロックTaq抗体を使用することで良好な直線性が得られた

反応溶液をダブルブロック抗体でブロックし、ASF/ACTダブルプラスミドを100000、10000、1000、100コピー増幅し、標準曲線を作成した。

図6. ダブルブロック反応溶液で生成されたASF遺伝子（a）とACT遺伝子（b）の標準曲線

図6からわかるように、ASF遺伝子の標準曲線R2は0.998で、増幅効率は98.848%です。ACT遺伝子の標準曲線R2は0.998で、増幅効率は98.113%でした。

4.6 ダブルブロックTaq抗体は酵素活性を急速に放出できる

Taqポリメラーゼを輸入T社の抗体とYeasenのダブルブロック抗体（cat#31303）でそれぞれブロックし、95℃で20秒間の熱ショック後に酵素活性を検出しました。31303は、95℃で20秒間の熱ショック後に95％以上の酵素活性を放出できることがわかり、これはT社の抗体と同等です。

表1. 酵素活性

4.7 ダブルブロックTaq抗体は多くの種類のTaq酵素をブロックできる

3種類のTaq酵素（野生型と2種類の変異体）がYeasenのダブルブロック抗体（cat#31303）によってブロックされ、ブロック率は1μg：5Uで、蛍光値とシーリング効率を測定しました。Yeasenのダブルブロック抗体（cat#31303）のブロック効果は、さまざまなタイプのTaq酵素に対して優れていることがわかります。

表2. さまざまなタイプのTaq酵素の阻害効率

4.8 イェーセンのダブルブロックTaq抗体はマウスではゲノム残基を持たなかった

水をネガティブコントロールのテンプレートとして、マウスゲノムをポジティブコントロールのテンプレートとして、31303 の異なるバッチを増幅しました。サンプルではターゲットフラグメントが増幅されなかったことがわかり、抗体にマウスゲノムの残留物がないことがわかりました。

図7. マウスゲノム残基検出図

注: - はネガティブコントロール、+ はポジティブコントロール、1-5 は異なるバッチの 31303 サンプルです。

5. 製品情報