dNTP は、PCR で使用されるパターン化されたリボヌクレオチド三リン酸の略で、成長中の DNA 鎖を増幅することができます。言い換えると、PCR の dNTP は水素結合を介して相補的な DNA 鎖と結合し、成長中の DNA 鎖は Taq DNA ポリメラーゼの助けを借りて拡張されます。PCR における dNTP の具体的な用途は何ですか? 高純度 dNTP に必要な特性は何ですか?

1. dNTP とは何ですか?
2. PCR における dNTP の濃度はどれくらいですか?
3. 高純度 dNTP に必要な特性は何ですか?
4. 関連製品と実績

1. dNTP とは何ですか?

デオキシヌクレオシド三リン酸 (dNTP) は、デオキシリボース (リボース、塩基、リン酸からなるヌクレオチドの鎖) を含むヌクレオシド三リン酸です。dNTP は核酸分子の重要な構成要素であり、PCR ミックスの必須成分です。dNTP がなければ、新しい増幅 DNA は生成できません。DNA 配列を構成する 4 つのデオキシヌクレオチドには、デオキシアデノシン三リン酸 (dATP)、デオキシチミジン三リン酸 (dTTP)、デオキシシチジン三リン酸 (dCTP)、デオキシグアノシン三リン酸 (dGTP) があります。さらに、PCR、cDNA 合成、qPCR、シーケンシング、クローニング、DNA 標識付けなどの多くの手順を成功させるには、dNTP の品質も重要です。

dNTP（デオキシヌクレオチド三リン酸）には 4 つの種類があり、それぞれ異なる DNA 塩基を使用します。アデニン（dATP）、シトシン（dCTP）、グアニン（dGTP）、チミン（dTTP）です。伸長段階で dNTP を使用すると、DNA に取り込まれて構成要素のように 2 倍になる準備のできた単一の塩基が提供されます。この技術の目的は新しい DNA を合成することであるため、dNTP は片側をテンプレートにして「解凍された」鎖にヌクレオチドを提供します。これにより、DNA の 1 本の鎖が 2 本になり、最終の保持段階まで試薬が残っている限り、指数関数的に継続できます。

2. PCR における dNTP の濃度はどれくらいですか?

PCR は、目的の DNA フラグメントの複数のコピーを生成し、ゲル電気泳動で視覚化できるようにするために実行される、in vitro の DNA 合成技術です。PCR の目的は、DNA シーケンシングや DNA マイクロアレイのさまざまな下流アプリケーション用に DNA の大量のコピーを作成することです。そのコンポーネントには、DNA テンプレート、プライマー、バッファー、および Taq DNA ポリメラーゼ dNTP が含まれます。PCR のメカニズムを理解するには、使用されるコンポーネントの重要性と原理を理解する必要があります。dNTP は PCR の重要なコンポーネントの 1 つです。PCR における dNTP の機能は、Taq DNA ポリメラーゼの助けを借りて成長中の DNA 鎖を増幅し、水素結合によって相補的な DNA 鎖と結合することです。

PCR のプロセスは、変性、アニーリング、および伸長という、温度に依存する 3 つのステップに分かれています。変性ステップでは、二本鎖 DNA が一本鎖 DNA に変性します。アニーリングステップでは、プライマーが相補配列の正確な位置に結合し、伸長ステップでは、Taq DNA ポリメラーゼが伸長中の DNA 鎖に dNTP を追加します。鎖が開き、プライマーが一本鎖 DNA に結合すると、Taq DNA ポリメラーゼが触媒活性を開始します。次のステップでは、dNTP の追加が始まり、正確な相補ヌクレオチドが存在する場合、P-DNA 複合体に低い親和性で結合します。Taq DNA ポリメラーゼが保持した直後に、相補塩基と dNTP の間で水素結合相互作用が発生します。ここで、結合するかどうかを決定するのは、最初のヌクレオチド全体ではなく、dNTP 上の塩基 (窒素塩基) です。まず、テンプレート ssDNA 上に相補的な塩基 (T の代わりに A、C の代わりに G) が見つかると、それらの間に水素結合が形成されます。C と G の間に 3 つの水素結合、A と T の間に 2 つの水素結合が形成されます。水素結合が形成されると、Taq DNA ポリメラーゼは、リン酸ジエステル結合を形成することにより、成長中の DNA 鎖への dNTP の組み込みに従います。リン酸ジエステル結合が形成された後、Taq DNA ポリメラーゼは、新しい dNTP の追加という次のステップに進みます。プライマーの 3'OH と dNTP の 5'P の間にリン酸ジエステル結合が形成されます。水素結合後、Taq DNA ポリメラーゼは、dNTP の三リン酸からガンマリン酸とベータリン酸を除去することにより、反応を触媒します。反応が完了すると、2 つのピロリン酸 (PPi) が放出されます。しかし、PCR 反応における dNTP と Taq ポリメラーゼの相互作用の正確な速度論は不明のままです。

これら 4 つのヌクレオチドは、通常、塩基の最適な取り込みのために等モル量で PCR 反応に加えられます。ただし、PCR によるランダム突然変異誘発などの特定の状況では、非校正 DNA ポリメラーゼによる誤取り込みの度合いを高めるために、不均衡な dNTP 濃度が意図的に供給されます。最小 dNTP 濃度を決定する要因は、ターゲット配列の DNA の長さと構成です。PCR 反応では、dNTP は通常 50～200 μmol/L です。最終的な dNTP 濃度が 50 mmol/L を超えると、Taq DNA ポリメラーゼの活性が阻害される可能性があります。1 つの dNTP の不足による増幅中の誤取り込みを減らすには、4 つの dNTP の濃度を等しくする必要があります。

一般的な PCR アプリケーションでは、各 dNTP の推奨最終濃度は通常 0.2 mM です。Mg ²⁺が高濃度に存在する場合は特に、Mg ^{2+ が dNTP に結合してその取り込み率を低下させ、非特異的率を高めるため、場合によってはより高い濃度が役立つことがあります。dNTP にはリン酸が含まれており、Mg 2+と}結合して遊離 Mg ²⁺の濃度を低下させる可能性があるため、その濃度の変化は Mg ²⁺の有効濃度に影響します。DNA および dNTP の濃度が高い条件下では、Mg ²⁺濃度をそれに応じて調整する必要があります。また、dNTP が不足すると PCR 産物が不完全になります。ただし、dNTP が最適濃度を超えると PCR が阻害される可能性があります。DNA ポリメラーゼによる効率的な取り込みのためには、反応液中の遊離 dNTP が 0.01～0.015 mM 以上の濃度で存在する必要があります。

 

3. 高純度 dNTP に必要な特性は何ですか?

ポリメラーゼ連鎖反応は、その発見以来、分子遺伝学研究で使用される比類のないツールです。PCR では、成長中の DNA 鎖を拡張するために dNTP が使用されます。システム内の dNTP の品質が悪いと、最終製品の特性に悪影響を及ぼします。Yeasen の高純度 dNTP は、あらゆる種類の高感度で再現性の高い DNA 合成アプリケーションに適しています。

Yeasen は、すぐに使用できる GMP グレードのヌクレオチド、セット、ミックスを提供しており、pH 7.0 の精製水中のナトリウム塩として供給されます。製造プロセスでは不純物や PCR 固有の阻害剤が排除され、dNTP は分子生物学アプリケーション用に特別に製造されています。dNTP は分取 HPLC で精製され、少なくとも 99% の純度を備えています。PCR、RT-qPCR、LAMP、DNA 標識、DNA シーケンシング プロセスで使用できます。
厳格な管理基準と最先端の技術により、製品の最高品質が保証されます。dNTP の各ロットは、さまざまな残留物 (細菌 DNA、ヒト DNA、DNase、RNase、エンドヌクレアーゼ) についてテストされています。製品はバッチごとに安定しており、あらゆる種類の高感度で再現性の高い DNA 合成アプリケーションに適しています。

4. 関連製品と実績

4.1 細菌DNA残留物なし

図 1. 検出結果は、dNTP に細菌ゲノム残基がないことを示しています。

4.2 ヒトDNA残留物なし

図 2. 検出結果は、dNTP にヒトゲノム残基がないことを示しています。

4.3 DNase、RNase、エンドヌクレアーゼの汚染なし

図 3. 検出結果は、dNTP に DNase、RNase、エンドヌクレアーゼが含まれていないことを示しています。

4.4 PCR増幅（20 kb DNA）

図 4. PCR 増幅結果は予想通り 20 kb の産物です。

4.5 製品情報

Yeasenが提供する製品は以下の通りです。

表1. 製品情報