2022年3月以来、狡猾なオミクロン変異株が再び人々の平穏な生活を破壊し、新型コロナウイルスの流行が全国で発生し、30の省（自治区、直轄市）に影響を及ぼしました。SARS-CoV-2流行の正確な予防と制御の有効な手段として、核酸検出は日常の生活様式になりました。「今日は核酸検査をしましたか？」それは人々の日常の挨拶にもなりました。そういえば、核酸検出に必要なコア原料が何であるか知っていますか？この記事では、核酸検出酵素の重要なコア原料を紹介します。

1. SARS-CoV-2の核酸検出プロセス

2. 核酸抽出におけるコア酵素

3. RT-qPCR中のコア酵素

4. YeasenによるSARS-CoV-2核酸検出のコア酵素

1. SARS-CoV-2の核酸検出プロセス

酵素は、高い触媒効率と反応特異性を備えた極めて重要なクラスの生体触媒です。ほとんどの生化学反応には酵素の関与が必要です。2019-nCoVの核酸検出プロセス（図1を参照）では、核酸抽出やRT-qPCRなどのさまざまな実験段階で、さまざまな種類の分子酵素が重要な役割を果たします。次に、核酸検出におけるさまざまな実験リンクに応じて、核酸検出プロセスで使用されるコア酵素原料を分類します。

図1. SARS-CoV-2の核酸検出プロセス

2. 核酸抽出におけるコア酵素

新型コロナウイルスの核酸抽出プロセスは、主に溶解と精製の2つのステップで構成されています。溶解は、サンプルの細胞構造を破壊し、サンプル内の核酸が溶解システム内で自由になるプロセスです。精製は、核酸を溶解システム内のタンパク質、塩、その他の不純物などの他の成分から完全に分離することであり、反応プロセスにはプロテイナーゼK、デオキシリボヌクレアーゼI、およびRNase阻害剤の関与が必要です。

2.1 プロテアーゼK

プロテイナーゼ K は、幅広い切断活性を持つセリンプロテアーゼであり、切断部位は脂肪族および芳香族アミノ酸のカルボキシ末端ペプチド結合です (図 2)。核酸抽出プロセスでは、プロテイナーゼ K は核酸と密接に結合したヒストンを分解し、核酸の分離を促進し、サンプル核酸の抽出を容易にします。さらに、プロテイナーゼ K は RNA 加水分解酵素 (RNase) の活性を分解し、テンプレート RNA の RNase 加水分解を阻害します。

図2. プロテアーゼKによるペプチド結合の加水分解の模式図

Yeasen Biotech Proteinase K (Cat#10401ES) は、組み換え酵母株から抽出され、比活性は 30 U/mg 以上、RNase および DNase を含まず、尿素および SDS 溶液中で安定した酵素活性を示します。広い pH 範囲 (pH 4.0~12.0) で活性があり、in situ ハイブリダイゼーション サンプル調製や核酸精製などのタンパク質の切断および除去に適しています。

2.2 デオキシリボヌクレアーゼI

デオキシリボヌクレアーゼI（DNase I）は、さまざまな形態のDNAを触媒し、ピリミジンに隣接するホスホジエステル結合の切断を標的とし、5'末端にリン酸基、3'末端にヒドロキシル基を持つポリヌクレオチドを生成します。平均的な消化産物は最小のポリテトラヌクレオチドです。SA​​RS-CoV-2核酸抽出プロセスでは、DNase Iは主にRNAサンプルのゲノム汚染を除去し、RNAテンプレートのDNA残留を回避し、テンプレートの純度を向上させるために使用されます。

Yeasen Biotech DNase I (Cat#10325ES) は、RNase フリーの組み換え E. coli 株から抽出されており、さまざまな RNA サンプルの処理に使用できます。最適な動作 pH 範囲は 7.0 ～ 8.0 です。Mg2+ が存在する場合、DNase I は二本鎖 DNA の任意の部位をランダムに切断できます。一方、Mn ²⁺が存在する場合、DNase I は二本鎖 DNA を同じ部位で切断し、平滑末端または 1 ～ 2 ヌクレオチドの突出した粘着末端を形成します (図 3 を参照)。

図3. Mg ²⁺およびMn ²⁺存在下でのDNase IによるdsDNAの切断の模式図

2.3 RNase阻害剤

SARS-CoV-2 核酸検出のプロセスでは、サンプル核酸の抽出と精製、または実験反応システムの準備により、リボヌクレアーゼ (RNase) 汚染が発生し、RNA テンプレートが分解される可能性があります。RNase 汚染を回避するには、RNase 阻害剤が必要です。

RNase 阻害剤は、ヒト胎盤中の特異的 RNase 阻害剤であり、RNase に特異的に結合して非共有結合の複合体を形成し、RNase を不活性化します。 Yeasen Biotechマウス RNase 阻害剤(カタログ番号 10603ES) には、ヒトタンパク質の酸化に対して非常に敏感な 2 つのシステインが含まれていません。 抗酸化活性が高く、さまざまなタイプの RNase (RNase A、B、C) を幅広く阻害できるため、qPCR などの高ジチオトレイトール (DTT) に敏感な実験に適しています。

3. RT-qPCR中のコア酵素

SARS-CoV-2サンプルの核酸抽出が完了したら、RT-qPCRで核酸検出を完了できます。これらの実験のプロセスでは、DNAポリメラーゼ、逆転写酵素、ウラシルDNAグリコシラーゼはすべて重要なコア酵素原料です。

3.1 逆転写酵素

抽出と精製後、SARS-CoV-2 RNAは、テンプレートRNAに相補的なcDNA配列を生成するために、dNTP重合を触媒する逆転写酵素を必要とします（図4）。RT-qPCR反応では、耐高温性の逆転写酵素を選択する必要があります。現在、MMLV逆転写酵素が最も広く使用されています。DNAエンドヌクレアーゼ活性がなく、RNase H活性が低いため、cDNAクローニングの応用においてより多くの利点があります。

図4. 逆転写プロセスの概略図

Yeasen Biotech Hifair™ V 逆転写酵素(Cat#11300ES) は、遺伝子工学技術によって得られた新しい逆転写酵素です。熱安定性に優れ、60°C までの反応温度に耐えることができます。また、複雑な二次構造を持つ RNA テンプレートの逆転写にも適しています。同時に、この酵素はテンプレートとの親和性を高め、少数のテンプレートと低コピー遺伝子の逆転写に適しており、最大 10 kb の cDNA を増幅できます。

3.2 DNAポリメラーゼ

テンプレート逆転写プロセスが完了して二本鎖 cDNA が生成されると、PCR 反応における「ソウル プレーヤー」DNA ポリメラーゼが登場し、遊離デオキシリボヌクレオチドを重合して DNA 鎖を延長し、大量のテンプレート DNA を体外で増幅してウイルス核酸検出の目的を達成する必要があります。

RT-qPCR 反応で一般的に使用される DNA ポリメラーゼは、ホットスタート Taq DNA ポリメラーゼです。このタイプの酵素は室温では不活性です。ホットスタート後にのみ重合活性を持ち、バックグラウンド信号の発生を最小限に抑えることができます。従来の PCR 反応でプライマーダイマーの生成やミスマッチによって引き起こされる非特異的増幅の問題を解決します。現在、一般的に使用されている DNA ポリメラーゼのホットスタート修飾方法には、主に化学修飾、リガンド修飾、抗体修飾が含まれます。さまざまなホットスタート修飾方法の原理を図 5 に示します。

図5. さまざまなタイプの改変ホットスタート酵素の模式図

Yeasen Biotech UNICONTM Hotstart High Specific Taq DNA Polymerase 、5 U/μL（Cat#10726ES）は、高いテンプレート親和性を備えたダブルブロッキングホットスタートDNAポリメラーゼです。室温では、5'→3'ポリメラーゼ活性がブロックされるだけでなく、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性もブロックされます。95°Cで30秒間変性すると、ブロッキング抗体が完全に不活性化され、DNAポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性が解放されます。ダブルブロッキング機能により、ミスマッチやプライマーダイマーによる非特異的増幅を効果的に防止できるだけでなく、プローブの劣化による蛍光シグナルの減少も効果的に抑制できます。この二重保証により、輸送中や室温での使用中に、in vitro検出試薬がより安定します。

3.3 ウラシルDNAグリコシラーゼ

新型コロナウイルスの核酸検出のプロセスにおいて、作業環境におけるエアロゾル汚染は、PCR結果が偽陽性となる最も一般的な要因です。UDG酵素（ウラシルDNAグリコシラーゼ、ウラシルDNAグリコシラーゼ）を増幅システムに追加すると、PCRシステムに混入した増幅残留汚染物質（主にエアロゾルの形態）を効果的に除去し、増幅結果の精度を確保できます。UDG酵素の汚染防止原理を図6に示します。

図6. UDG酵素の抗汚染原理の模式図

Yeasen Biotech ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG/UNG)、熱不安定、1 U/μL (カタログ番号 10303ES) は、25 ～ 37°C で活性で、熱に敏感で、50°C で 10 分間または 95°C で 2 分間で不可逆的に不活性化されます。エンドヌクレアーゼおよび RNase 残基はなく、宿主細菌ゲノム残基は 10 コピー未満です。ホットスタート Taq DNA ポリメラーゼと組み合わせて使用​​することで、増幅反応の特異性を確保できます。

4. YeasenによるSARS-CoV-2核酸検出のコア酵素

読書に関して：

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