近年、mRNA技術の開発と応用が注目を集め続けています。mRNA医薬品は、抗原タンパク質をコードするmRNAを人体に接種し、人体細胞内の遺伝物質を利用して抗原タンパク質を発現・合成します。このプロセスにより、抗原タンパク質を介して人体の免疫系を誘導・活性化し、病気の予防と治療を目指します。mRNA医薬品は、安全性、効率性、サイクルの短さなどの利点があり、体液性免疫と細胞性免疫を同時に誘導できるため、腫瘍、感染症、希少疾患、心血管疾患など、さまざまな適応症に応用されています。
mRNA 医薬品開発のプロセス全体は、大まかにいくつかのステップに分けられます。
配列決定と設計 - mRNA in vitro転写 - カプセル化の準備
mRNA の in vitro 転写 (IVT) の従来の手順は次のとおりです。
プラスミド DNA 抽出と線状化—プラスミド DNA 精製— in vitro 転写 (共転写キャッピング) — 精製 — mRNA ストック溶液
ワンポット mRNA 体外転写 (IVT) プロセスには以下が含まれます。
プラスミド DNA 抽出と線状化—インビトロ転写 (共転写キャッピング) — 精製 — mRNA ストック溶液
現在、既存のプロセスのほとんどは、IVT ステップの前に酵素切断後のプラスミド DNA の単一の精製ステップを伴います。
プロセスの利点:
- プロセスの最適化により、IVT ステップが削減され、操作が簡素化されます。
- 材料コストが削減され、切断後の精製や品質検査が不要になります。
- mRNA の品質と収量を維持します。
データ：
1. 利回りと完全性:
1μg の線形化された 2K、4K、および 9K プラスミドを使用して、ワンポットプロセスで 150～200μg の mRNA を生成できます。
| 長さ | 利回り | 誠実さ |
| 2K | 200μg | 94.00 % |
| 4K | 185μg | 92.20 % |
| 9K | 150μg | 87.50 % |
キャピラリー電気泳動 (CE) を使用して完全性テストを実行し、長さ 2K、4K、9K の断片の完全性を評価しました。2K および 4K 断片の完全性は 92% 以上、9K 断片の完全性は 87% 以上でした。
2. mRNAキャッピング効率の検出
LC-MS を使用して 2K 配列のキャッピング効率を評価したところ、キャッピング効率は 99.5% であることが明らかになりました。
上の画像: HPLC UVクロマトグラム
下の画像: デコンボリューションされた分子量スペクトル
3. mRNAポリアデニル化効率の検出
LC-MS を使用してサンプルのポリアデニル化効率を検出し、正規分布した結果を示しました。
上の画像: 液体クロマトグラフィー TIC クロマトグラム
下の画像: デコンボリューションされた分子量スペクトル
4. mRNA発現アッセイ
従来のプロセス(左、精製した線状化プラスミド)とワンポット プロセス (右、精製していない線状化プラスミド) の両方を使用して合成した mRNA 産物を 293T 細胞にトランスフェクションしたところ、培養 24 時間後に蛍光タンパク質の発現に違いは見られませんでした。
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