パンデミック中に良好な結果を達成し、大きな可能性を示しているにもかかわらず、mRNA技術には、発現時間が短い、タンパク質の翻訳が限られているなど、依然としていくつかの制限があります。これらの特徴は一定レベルの安全性を提供できますが、タンパク質補充などの治療法には制限となります。タンパク質の発現レベルを維持するために繰り返し投与する必要があり、免疫原性や中和抗体などの新たなリスクと課題が生じます。
自己増幅RNA（saRNA）は、従来のmRNAの数百倍、あるいは数千倍の少ない投与量で、同じ免疫反応を生成できます。投与量が少ないということは、製造コストが低いことを意味し、注射の頻度が少ないと、mRNAと送達ベクターによる潜在的な毒性副作用を減らすことができます。現在、いくつかのsaRNA候補が世界中で臨床試験に入っています。BioNTechなどの大手企業は、saRNA技術パイプラインを積極的に開発しています。
saRNA はコストと安全性の面で大きな利点がありますが、その独特な構造により、製造上の新たな課題が生じています。RNA ポリメラーゼをコードする配列とターゲット タンパク質配列を組み合わせた saRNA 分子は、従来の mRNA よりもはるかに大きく (約 10kb)、より複雑です (二次構造が多く含まれています)。これにより、in vitro 転写反応の難易度が大幅に上がり、saRNA 製造の収量と純度が低下します。したがって、saRNA 製造には、合成、分離、および精製プロセスにおいてより高い基準が求められます。
分離精製法であるアフィニティークロマトグラフィーは、目的産物の収率や完全性が低いなどの問題があります。複数のクロマトグラフィー精製法（セルロースクロマトグラフィーの追加、疎水性逆相クロマトグラフィーなど）を組み合わせることは煩雑で、新たな不純物が導入され、回収率が低く、コストがかかります。さらに、大規模生産に使用されるIVT反応システムは、100ntの核酸配列の合成に適したシステムから最適化されているため、サイズが10kbを超えるsaRNAには適していません。そのため、既存のIVT反応システムの最適化が必要です。現在、従来のmRNA精製法では、工業用原料液の品質要件を満たすことができません。そのため、自己増幅RNA用の完全かつ効率的な工業用グレードの分離精製プロセスを開発し、最適化することが急務となっています。
工業生産と精製方法の最適化
自己増幅 mRNA (saRNA) の工業生産システムを開発するには、まず小規模で IVT 共転写システムのバッファーイオンの種類と成分を最適化することが不可欠です。これには、下流の精製プロセス用のクロマトグラフィーバッファーとサンプル洗浄比の改良も含まれます。その後、これらの最適化された条件を大規模生産にスケールアップして、システムが生産能力を効果的に高め、原料製品の品質を向上できるかどうかを検証できます。
共転写キャップ付加反応システム
共転写キャップ付加反応システムでは、T7 バッファー成分には 400 mM HEPES、20 mM スペルミジン、100 mM DTT、および Mg2+ 塩が含まれます。
T7 バッファー - マグネシウムイオン塩タイプ
使用されるマグネシウムイオン塩の種類は、対象となる saRNA 製品の収量と完全性に影響します。
- 1 mg mRNA の小規模共転写合成では、Mg2+ 塩として Mg(OAc)2 を使用すると、それぞれ 100.5 µg と 62.9% という最高の収量と完全性が得られます。
- 対照的に、MgCl2 や MgSO4 などの他のマグネシウムイオン塩を使用すると、収率が約 25 ～ 50%、完全性が約 10% 低下し、収率と完全性の両方が大幅に低下します。
T7 バッファー - マグネシウムイオン濃度
酢酸マグネシウムイオンの最適濃度 (30 ～ 50 mM) により、ターゲット saRNA の収量と完全性が向上し、35 mM で最良の結果が得られます。
- 酢酸マグネシウムイオン濃度が30〜50mMの場合、saRNA収量は88.5〜100.5µgに達し、完全性は58.6〜62.9％となり、良好な結果が得られました。
- 濃度 35mM では、収量と完全性が最高となり、それぞれ 100.5µg と 62.9% に達します。
T7 バッファー - 他の塩と組み合わせたマグネシウムイオン塩
T7 バッファーに他の塩を追加すると、対象製品の収量と完全性が大幅に向上します。
- 基本 T7 バッファーには 400mM HEPES、20mM スペルミジン、100mM DTT、および Mg2+ 塩が含まれており、収量と完全性はそれぞれ 100.5µg と 62.9% になります。
- 2 番目の塩である NaOAc を追加すると、収量と完全性がさらに向上します。収量は 20 ～ 110 µg 増加し、完全性は約 2 ～ 8% 向上します。
T7 バッファー - 複合塩の濃度
2 番目の塩成分 NaOAc (Na+) の濃度が 5 ～ 30 mM の場合、ターゲット saRNA の収量と完全性が大幅に向上し、最適な濃度は 15 mM です。
- Na+濃度が3〜30mMの場合、saRNAの収量は120〜210µgに達し、完全性は64.4〜70.2%となり、良好な結果が得られました。
- Na+ 濃度が 15mM の場合、収量と完全性は最高となり、それぞれ 210µg と 70.2% に達します。
単一精製法
小規模 (<50 mg) の saRNA の製造と精製では、さまざまな精製方法を使用することで、dsRNA 含有量とタンパク質残留物を大幅に削減し、高収量、キャッピング効率、および製品の完全性を確保できます。精製方法の有効性は、最良から最悪の順に、アフィニティークロマトグラフィー > 塩化リチウム沈殿 > 限外濾過、セルロースクロマトグラフィーの順です。
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アフィニティークロマトグラフィー
大規模な mRNA 生産には、クロマトグラフィーが適しています。オプションには、逆相、イオン交換、疎水性、アフィニティークロマトグラフィーがあり、それぞれに長所と短所があります。ポリ (A) mRNA の捕捉によく使用されるアフィニティークロマトグラフィーは、90% を超える回収率で拡張性とプラットフォーム ソリューションを提供します。
mRNA の主要な構造的特徴である 5' キャップと 3' ポリ (A) テールにより、精製が容易になります。磁気ビーズ精製と同様に、アフィニティークロマトグラフィーでは、dT 結合ビーズを使用してポリ (A) テール mRNA を捕捉します。高塩分条件では負電荷が遮蔽され、AT 水素結合による結合が可能になり、mRNA は穏やかな中性 pH と低伝導率で溶出されます。
RNA のアフィニティークロマトグラフィーには、「高塩結合、低塩溶出」が含まれます。バッファーの組成、分子サイズ、温度、サンプル濃度はプロセスに大きな影響を与えます。実験を通じて最適な塩の種類と濃度を選択することが、効率的な精製には不可欠です。
精製: この方法は、製品の完全性が最も高く (80.3%)、dsRNA 含有量が最も低く (0.01µg/mg)、キャッピング効率が最も高く (96.4%)、タンパク質残留物が最も少なく (1.20µg/mg)、収量は 136µg、回収率は 65% で、製品の純度と品質の点で最高のものとなっています。
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その他の精製方法:
塩化リチウム沈殿
LiClを使用してmRNAを精製する原理は、リチウムが特定のpHで分子間の静電反発力を減らし、効率的なRNA沈殿を可能にすることです。その後、沈殿物を遠心分離で分離し、溶解して純粋なRNAサンプルを取得します。LiCl沈殿はシンプルで高速で、さまざまなサイズのmRNAに効果的であり、高純度の製品を生み出します。ただし、残留リチウムイオンはmRNAを阻害する可能性があります。精製効率を確保するために、少なくとも400µg/mlのRNAを含む溶液にはLiCl沈殿を使用することをお勧めします。この方法では高収量（210µg）が得られますが、製品の完全性は70.2％に過ぎず、製品の品質が大幅に低下します。大規模生産には適していません。
磁気ビーズ法：
磁気ビーズは磁場下で一方向に移動する小さな粒子で、通常は鉄酸化物コアと外部コーティングで構成されています。磁気ビーズ精製は、混合物から mRNA 分子を迅速かつ効率的に濃縮するための一般的な分子生物学技術です。さまざまな機能を持つ磁気ビーズには、さまざまな生体分子を精製するためのさまざまな表面官能基 (例: ヒドロキシル、カルボキシル、オリゴ (dT)、ストレプトアビジン) があります。
カルボキシル化磁気ビーズは、酸性条件下で静電相互作用を介して mRNA 分子を結合し、核酸を効率的に精製できます。条件を調整することで、mRNA を選択的に結合および解放できます。露出した負に帯電したリン酸基が多い長い mRNA は、ビーズに簡単に結合します。短い mRNA の場合は、より大きなビーズ容量が必要になる場合があります。オリゴ (dT) 結合磁気ビーズは、アフィニティークロマトグラフィーと同様に、mRNA のポリ (A) テールとビーズのオリゴ (dT) 間の特定の結合を利用します。
限外濾過
この方法では、saRNA の完全性は最も低く、アフィニティークロマトグラフィーよりも約 8% 低く、タンパク質残留物 (4.58µg/mg) は最も高くなります。
セルロースクロマトグラフィー
この方法では、dsRNA 含有量が低く (0.009µg/mg)、キャッピング率も高く (96.4%) なっています。ただし、タンパク質残留物はわずかに高く (5.30µg/mg)、回収率はわずか 57%、収量は 120µg で、どちらもアフィニティークロマトグラフィーで達成される値よりも大幅に低くなっています (それぞれ約 10% と 16µg)。
精製プロセス
クロマトグラフィー緩衝液成分 - 還元剤の添加
精製中にクロマトグラフィーバッファーに還元剤を添加すると、還元剤を添加しない場合と比較して、副産物の dsRNA およびタンパク質残留物のレベルを減らしながら、製品の完全性、回収率、およびキャッピング効率を大幅に向上させることができます。
- 還元剤なし:
- 収量: 136µg
- 回復率: 65%
- 誠実さ: 80.3%
- dsRNA: 0.01µg/mg
- キャッピング効率: 96.4%
- タンパク質残留物: 1.20µg/mg
- 製品の純度と品質は良好です。
- 還元剤（TCPE、DTT、β-メルカプトエタノール）を含む：
- 収量が10～40µg増加
- 回復率が5～18%増加
- 整合性が約1～5%向上します
- キャッピング効率: 96.4%
- dsRNA: 0.005µg/mgと低い
- タンパク質残留物: 0.20µg/mgと低い
- 製品の純度と品質が大幅に向上しました。
クロマトグラフィー緩衝液成分 - 還元剤の種類
クロマトグラフィーバッファーにさまざまな種類の還元剤を追加すると、dsRNA とタンパク質の残留物を減らしながら、製品の完全性、回収率、キャッピング効率をさらに向上させることができます。TCPE が最も効果的な還元剤であることがわかっています。
- TCPE の場合:
- 収量: 175µg
- 回復率: 83%
- 誠実さ: 85.2%
- dsRNA: 0.005µg/mg
- キャッピング効率: 96.4%
- タンパク質残留物: 0.20µg/mg
- 優れた製品の純度と品質。
クロマトグラフィー緩衝液成分 - 還元剤の濃度
クロマトグラフィーバッファーに 5 ～ 15 mM の濃度で還元剤を加えると、dsRNA とタンパク質の残留物を減らしながら、製品の完全性、回収率、キャッピング効率を大幅に向上させることができます。最適な濃度は 10 mM です。
- 5〜15mM TCPEの追加:
- 収量: 160-178µg
- 回復率: 76-85%
- 完全性: 約85%
- dsRNA: 0.002-0.005µg/mg
- キャッピング効率: 96.4%
- タンパク質残留物: 0.20-0.52µg/mg
- 製品の純度と品質が良好です。
- 10mM TCPEの場合:
- 収量: 178µg
- 回復率: 85%
- 誠実さ: 85.4%
- dsRNA: 0.002µg/mg
- キャッピング効率: 96.4%
- タンパク質残留物: 0.20µg/mg
- 最適な製品の純度と品質。
洗浄率
洗浄プロセスにおけるクロマトグラフィー緩衝液と注入水の比率を（10〜25）：（75〜90）に制御すると、製品の完全性、回収率、キャッピング効率が大幅に向上し、dsRNAとタンパク質の残留物を減らすことができます。最適な比率は15：85です。
- 比率 (10-25):(75-90):
- 収量: 150-179µg
- 回復率: 71-85%
- 誠実さ: 84-90%
- dsRNA: 0.002-0.006µg/mg
- キャッピング効率: 96.4%
- タンパク質残留物: 約0.20µg/mg
- 製品の純度と品質が良好です。
- 比率15:85の場合:
- 収量: 179µg
- 回復率: 85%
- 誠実さ: 90.0%
- dsRNA: 0.002µg/mg
- キャッピング効率: 96.4%
- タンパク質残留物: 0.20µg/mg
- 最適な製品の純度と品質。
複合精製法
さまざまな精製方法を組み合わせて使用すると、製品中の dsRNA およびタンパク質残留物のレベルをさらに低減し、全体的な品質を向上させることができます。精製方法の推奨順序は、アフィニティークロマトグラフィー > 限外濾過 + アフィニティークロマトグラフィー > アフィニティークロマトグラフィー + セルロースクロマトグラフィー > セルロースクロマトグラフィー + 限外濾過です。アフィニティークロマトグラフィーのみを使用すると、最良の結果が得られます。
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アフィニティークロマトグラフィーのみ:
- 収量: 179µg
- 回復率: 85%
- 誠実さ: 90.0%
- dsRNA: 0.002µg/mg
- キャッピング効率: 96.4%
- タンパク質残留物: 0.20µg/mg
- 最高の製品純度と品質。
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限外濾過 + アフィニティークロマトグラフィー:
- 収量: 170µg (アフィニティークロマトグラフィーのみの場合より9µg少ない)
- 回収率: 81% (アフィニティークロマトグラフィーのみの場合より4%低い)
- 誠実さ: 88.5%
- dsRNA: 0.0015µg/mg
- タンパク質残留物: 0.18µg/mg
- アフィニティークロマトグラフィーのみの場合と比較して、dsRNA とタンパク質の残留物はわずかに減少しますが、収量と回収率は大幅に減少します。この方法はより複雑で、精製時間が 2 倍になり、コストが増加します。
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アフィニティークロマトグラフィー + セルロースクロマトグラフィー / セルロースクロマトグラフィー + 限外濾過:
- dsRNA: 単一法よりも0.005µg/mg低い
- 収量: 60-100µg未満
- 回復率: 30～40%低下
- 手順が増えると、人件費と材料費が高くなります。
大規模生産
大規模生産では、アフィニティークロマトグラフィー、セルロースクロマトグラフィーと組み合わせたアフィニティークロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーと組み合わせた限外濾過を使用することで、自己増幅mRNAの収量が140〜185µgに大幅に増加し、回収率は67〜88％です。製品の完全性は93〜94％、dsRNA含有量は0.0018〜0.0020µg/mg以内に制御され、キャッピング効率は96.1〜96.4％に達し、タンパク質残留物は0.04〜0.05µg/mg以内に保たれます。これは、大規模生産の優れたスケーラビリティと効率を示しています。
参照：
[8]自己増幅mRNA原液の工業的生産および分離精製方法とその応用[P]。特許：CN118048418A。2024.05.17 。
注文情報
| 製品名 | 製品コード | 仕様 |
| CleaScrip™ T7 RNAポリメラーゼ（低dsRNA、250 U/μL） | 10628ES | 10/100 KU |
| T7 RNAポリメラーゼGMPグレード（50 U/μL） | 10624ES | 5000/50000 ユニット |
| T7 RNAポリメラーゼGMPグレード（250 U/μL) | 10625ES | 10/100 KU |
| 10×転写バッファー2 GMPグレード | 10670ES | 1/10mL |
| ピロホスファターゼ、無機 GMP グレード0.1 U/ μL) | 10672ES | 10/100/1000 ユー |
| マウスRNase阻害剤GMPグレード | 10621ES | 10/20/100 KU |
| BspQI GMPグレード | 10664ES | 500/2500 ユー |
| DNase I GMPグレード | 10611ES | 500/2000/10000 ユニット |
| N1-Me-擬似UTPナトリウム溶液（100 mM） | 10651ES | 100μL/1mL |
| Hieff NGS™ RNAクリーナー | 12602ES | 1/5/60/450mL |
| ATPトリス溶液GMPグレード（100 mM） | 10652ES | 1/5/25/500ml |
| CTPトリス溶液GMPグレード（100 mM） | 10653ES | 1/5/25/500ml |
| GTPトリス溶液GMPグレード（100 mM） | 10655ES | 1/5/25/500ml |
| 擬似UTPトリス溶液GMPグレード（100 mM） | 10656ES | 1/5/25/500ml |
| N1-Me-擬似UTPトリス溶液GMPグレード（100 mM） | 10657ES | 1/5/25/500ml |
| ARCA (アンチリバースキャップアナログ) | 10681ES | 1/5/25/500ml |
| 二本鎖RNA（dsRNA）ELISAキット | 36717ES | 48T/96T |