Cap 構造は、mRNA ワクチンおよび治療薬の開発に不可欠な要素です。合成 mRNA 技術は、安定性と翻訳効率を高め、Toll 様受容体 (TLR) やその他の免疫センサーによる mRNA の自然免疫認識を減らし、不要な免疫活性化を最小限に抑えるために Cap1 に依存しています。これにより、望ましくない炎症反応が防止され、ヒト細胞における治療用 mRNA の安定性と有効性が向上します。
初期の発見とCap0の構造
1970 年代半ば、真核生物の mRNA の研究により、現在 Cap0 として知られる 5' 末端構造が発見されました。この構造では、N7-メチルグアノシン キャップ (m7G) が 5' 末端の最初のヌクレオチドに結合しています。この修飾は、mRNA をエキソヌクレアーゼによる分解から保護し、核外への輸送を助け、翻訳開始のためのリボソーム認識を促進することが分かりました。Cap0 は、メチル化がグアノシン キャップ自体に限定された、最初に特徴付けられたキャップ構造でした。この 5' キャップとその機能の発見は、真核生物の mRNA キャップと、mRNA 修飾におけるその役割を理解する上で大きな進歩となりました。
Cap1の出現
真核生物の mRNA の重要な特徴である Cap1 構造は、mRNA の安定性、翻訳、免疫認識において極めて重要な役割を果たします。mRNA キャップ構造は、5'-5' 三リン酸結合を介して最初のヌクレオチドに結合した N7-メチルグアノシン (m7G) で構成され、1970 年代の真核生物の mRNA 転写後修飾に関する初期の研究から発展しました。
5'末端キャップされたmRNAの構造【1】。さらに調査を進めたところ、ほとんどの真核生物のmRNAでは、キャップ（位置+1）に続く最初のヌクレオチドもリボースの2'-O位置でメチル化されており、このプロセスは2'-O-メチル化として知られています。Cap1構造（m7GpppNm）として知られるこの発見は、mRNA修飾に機能的重要性の新たな層を追加しました。Cap1修飾は、特に哺乳類細胞において、mRNAの安定性を微調整し、自然免疫系による免疫認識を防ぐことがわかり、RIG-I、TLR、MDA5などのパターン認識受容体による認識を回避するのに役立ちます【2】。これは、mRNA代謝と、mRNAワクチン接種や遺伝子治療への応用を含むmRNAベースの技術の進歩の両方にとって重要でした。
mRNA 業界における技術的課題と現在の解決策
mRNA ワクチンの広範な応用と最適化には、高用量 mRNA、免疫反応、安定性、送達など、いくつかの技術的課題が残っています。mRNA 業界における大きな課題は、強力な免疫反応を誘発するために高用量の mRNA が必要であることです。これにはいくつかの要因があります。
急速な分解: mRNA は本質的に不安定であり、生物系に存在する脱キャップ酵素やリボヌクレアーゼ (RNase) によって分解されやすいです。
限られた翻訳効率: mRNA がタンパク質に翻訳される効率は変化する可能性があり、免疫反応に十分な抗原レベルを生成するにはより多くの mRNA が必要になります。翻訳効率は Cap1 と翻訳開始因子 eIF4E の親和性に関係しています。
真核生物における基本的な翻訳開始複合体の形成【3】
免疫原性と望ましくない免疫反応: 3 番目に大きなハードルは、特に dsRNA または不完全な mRNA の場合、mRNA 自体によって引き起こされる可能性のある自然免疫反応です。適応免疫システムを刺激するには、一定レベルの免疫活性化が望まれますが、過剰な活性化は炎症反応を引き起こし、ワクチンの効果を低下させたり、副作用を引き起こしたりする可能性があります。
キャッピング技術の歴史
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酵素キャッピング技術: mRNA 研究の初期に導入された酵素キャッピングでは、グアニルトランスフェラーゼやメチルトランスフェラーゼなどのキャッピング酵素を使用して、転写後に天然の 5' キャップを追加します。この方法は、特に治療用途において、mRNA 翻訳における高い忠実度とキャッピング効率を保証します。
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合成キャップ類似体 (1980 年代 - 2000 年代):研究者は、キャップされた mRNA の in vitro 合成用に合成キャップ類似体を開発し、mRNA の機能と遺伝子発現の研究に役立てました。アンチリバース キャップ類似体 (ARCA) は、mRNA 合成中に誤ったキャップの組み込みを防ぐように設計された合成キャップ類似体で、ワクチンや遺伝子治療における mRNA の翻訳効率を向上させます。ただし、ARCA キャッピングのキャッピング効率と収率は低いです。
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Cap1 テクノロジー (2010 年代): TriLink の Cap1 は、mRNA 合成中にキャップを直接組み込むことでプロセスを簡素化する共転写キャッピング方法です。この方法は効率を高め、正しくキャップされた mRNA の割合が高くなるため、mRNA ワクチンなどの大規模な治療用途に最適です。
現在、酵素キャッピング技術は、COVID-19ワクチンを含むmRNAベースの治療法の開発において非常に重要であり、治療用mRNAの安定性と効果的な翻訳を確保しています。
酵素キャッピング、次世代LZCapキャッピング、第一世代キャッピング（ARCA）法の比較
次世代キャップアナログの開発
私たちは、脱キャップ酵素に対する耐性、翻訳効率を向上させるための eIF4E に対する高い親和性、およびより低い免疫原性を備えたキャップ類似体の開発を目指しました。これらの進歩は、抗がん治療や遺伝子治療への応用を含む mRNA ベースの治療の有効性を高めるために不可欠です。
LZCapの設計
LZCap の設計では、eIF4E に対する親和性の高いキャップ類似体の作成に主眼を置きました。酵素は基質を比較的「特異的に」認識します。そのため、新しいキャップ構造を設計する際には、可能な限り天然/既知の構造との類似性を維持するよう努めます。天然構造にはリボース 3' OH があり、これは変更可能です (例: メチル化)。この考慮に基づいて、新規性のために 3' 位置に炭素を追加し、続いて OH の水素結合を模倣するために NH を追加し、次に NH の塩基性を減らして水素結合能力を高めるためにアセチル基を追加することを選択しました。LZCap の活性は、おそらく水素結合の増加により、メチル化された天然キャップよりも優れています。メチル基やメトキシ基と比較して、アセチルアミノ基は、基質 (キャップ) と開始因子 (酵素) 間のファンデルワールス相互作用も増加させる可能性があります。
アセチルアミノ基の安定性
アセチルアミノ基はすでに十分に安定しています。キャップの最も不安定な部分である 7-メチル化位置とホスホジエステル結合よりもはるかに安定しています。
LZCapの収量とキャッピング効率
LZCap AG(3'Acm) キャップを使用すると、ルシフェラーゼ mRNA キャッピング効率は約 97.59% となり、T7 RNA ポリメラーゼを使用した標準的な in vitro 転写 (IVT) 反応で、1 μg の DNA テンプレートから最大 200 μg のキャッピングされた mRNA が得られます。mRNA の純度は、単純な LiCl 沈殿後、最大 99% になります。この高いキャッピング効率と収量により、LZCap はタンパク質生産や遺伝子治療など、さまざまな用途にとって魅力的な選択肢となります。
Cap 構造は、mRNA ワクチンおよび治療薬の開発に不可欠な要素です。合成 mRNA 技術は、安定性と翻訳効率を高め、Toll 様受容体 (TLR) やその他の免疫センサーによる mRNA の自然免疫認識を低減し、不要な免疫活性化を最小限に抑えるために Cap1 に依存しています。これにより、不要な炎症反応が防止され、ヒト細胞における治療用 mRNA の安定性と有効性が向上します。
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製品 |
キャップ AG (3'- O Me-7mG) |
LZキャップ AG(3'Acm) |
AG （キャッピングなし） |
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mRNA収量 (μg) |
164 |
173 |
200 |
RNAse Hベースの方法によるLZCappedルシフェラーゼmRNAのキャッピング効率のMS分析。キャッピング効率は約97.59%です。
脱キャップ酵素に対するmRNAの安定性はどうですか
LZCap AG(3'Acm) および LZCap AG M6 (3'Acm) を持つ mRNA は、脱キャップ酵素 (NEB) に対してより高い耐性を示します。CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) も脱キャップ酵素に対して耐性がありますが、通常の Cap AG (3'-OMe-7mG) は耐性を示さないことに注意してください。
LZCap と eIF4E の結合親和性はどうですか?
LZCap AG(3'Acm)キャップされたmRNAのタンパク質発現はどうでしょうか?
LZCap AG(3'Acm)キャップドルシフェラーゼmRNAの発現は、異なる細胞株*(3T3-L1、Hela、JAWs、HEK293T、Huh7)においてCap1類似体(3'-OMe-7mG)キャップドmRNAよりも大幅に高く、130回の繰り返し実験では、平均してLZCap AG(3'Acm)キャップドルシフェラーゼmRNAの発現が(3'-OMe-7mG)キャップドmRNAよりも約1.5倍高いことが示されました。マウスでも同様の結果が観察されています。タンパク質発現レベルは、mRNA配列によってわずかに異なる場合があります。
動物に関する他のデータはありますか?
LZCap AG(3'Acm)またはLZCap AG(3'FMom)キャップの発現効率
GLuc をコードする mRNA は、カニクイザルおよびブタにおいて CapAG (3'-OMe-7mG) キャップされた mRNA と比較して、生体内でより高い発現を示します。
LZCap AG キャップされた mRNA の自然免疫原性はどうでしょうか?
LZCapAG ( 3'Acm ) キャップ mRNA は低い自然免疫原性を示します。TLR8、TLR7、IL-1A および B は、キャップされていない RNA によって誘発される免疫応答において重要な役割を果たします。LZCapped mRNA 免疫原性分析の in vivo 研究では、キャップされていない RNA がマウスの免疫関連因子の転写レベルに大幅な変化を引き起こすことが示されました。LZCap および 3'-OMe-7mG キャップ mRNA は両方とも、マウスで 1 回の RNA 刺激注射後に同様に低い免疫因子転写レベルを示します。 
安全性テストはしましたか?
はい、細胞毒性試験、ヒトポリメラーゼ阻害試験、およびエームス試験を実施しました。
- 3'-Acm-7mG（CC50＞10000nM）のヌクレオシドモノマーは、293T、Huh7、MRC5、THP1、U87MG細胞において細胞毒性がほとんどないか全く観察されませんでした。
- ヒト DNA ポリメラーゼ (α、β、γ、およびクレノウ) およびミトコンドリア RNA ポリメラーゼ (hPOLRMT) 活性阻害研究では、3'-Acm-7mG TP はヒト DNA または RNA ポリメラーゼを阻害しないことが示されています。
- 細菌の復帰突然変異試験 (Ames) では、ほとんどのげっ歯類とヒトにおける関連する遺伝子変化と遺伝毒性発がん物質を検出します。Ames 試験では、3'-Acm-7mG に遺伝毒性がないことが示されました。
この製品は特許を取得していますか？
はい。米国で特許を取得しました。
注文情報
| 製品名 | 仕様 | カタログNo. |
| LZCap AG(3'Acm)（100 mM） | 100μL、1mL | 10684ES |
| LZCap AU(3'Acm) （ 100 mM ） | 100μL、1mL | 10685ES |
| LZCap GG(3'Acm)（ 100 mM） | 100μL、1mL | 10686ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy5)（ 25 mM） | 100μL、1mL | 10688ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy7) （ 25 mM ） | 100μL、1mL | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 mM) | 100μL、1mL | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-ビオチン) (25 mM) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Acm) ホタルluc mRNA (1μg/μL) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 μg/μL) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Acm) グルコースmRNA (1μg/μL) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
参照：
- コロナウイルスRNAキャッピングとメチル化の分子メカニズム、Virologica Sinica 31(1)
- mRNAワクチン — ワクチン学の新時代。Nat. Rev. Drug. Discov. 17, 261–279 (2018)。
- 哺乳類におけるRNA結合タンパク質による翻訳開始の制御：トランスアクティング因子による翻訳開始複合体の調節、Cells 2021、10(7)、1711