T7 高収率 RNA 合成キットは、転写反応システムを最適化します。このキットは、T7 RNA ポリメラーゼ、T7 プロモーター配列をテンプレートとする直鎖二本鎖 DNA、およびプロモーター下流の DNA 配列を制御する基質としての NTP を使用して、一本鎖 RNA を効率的に合成できます。転写中に、修飾ヌクレオチドを基質に加えて、ビオチンまたは色素標識 RNA を調製できます。

1. T7高収量RNA合成キットの紹介
2. in vitro転写の原理
3. Yeasen T7高収量RNA合成キットの利点
4. 製品のパフォーマンス
5. このキットの使い方
6. よくある質問
7. 注文情報

1. T7高収量RNA合成キットの紹介

T7 高収量 RNA 合成キットは、長い転写産物と短い転写産物の両方を合成でき、1 μg の DNA テンプレート入力で 100 ～ 200 μg の RNA を生成できます。合成された RNA は、RNA 構造と機能の研究、RNase 保護、プローブ ハイブリダイゼーション、RNA 干渉、マイクロインジェクション、 in vitro翻訳など、さまざまな下流アプリケーションに使用できます。

2. in vitro転写の原理

図1.インビトロ転写プロセス

3. Yeasen T7高収量RNA合成キットの利点

極めて高い収量 - 2時間で最大200µg
多用途 - 20nt～10000ntのRNA転写産物に最適
多用途 - ラベルなし、ラベル付き、キャップ付きRNAを生成

4. 製品のパフォーマンス

図2. IVT収量比較

注: すべての反応試薬は、 T7 RNA 合成キット(Yeasen#10623 または B* 社) からのものです。Yeasen 社と B* 社の IVT 反応収率は上記に示されています。

図3. 異なる長さの転写産物の品質

図4. HEK-293細胞における転写されたmRNAの発現レベル

注: mRNA はワクシニアキャッピング酵素 (Yeasen#10614/10615) でキャップされています。

5. このキットの使い方

5.1 解凍試薬

T7 RNA ポリメラーゼ ミックスを軽く遠心分離し、氷上に置きます。10× 転写バッファーとリボヌクレオチド (ATP、CTP、GTP、UTP) を解凍し、チューブの底まで混ぜて遠心分離し、10× 転写バッファーを室温に置き、4 種類のリボヌクレオチドを氷上に置きます。

5.2 次の表に従って転写反応系を準備する

表1. 転写反応系の調製方法

注記：
a) 反応は室温で準備されます。10×転写バッファーにはスペルミジンが含まれているため、低温でスペルミジンの濃度が高すぎると DNA テンプレートが沈殿します。
b) 短い転写産物（<100 nt）、2 µg のテンプレートが使用可能、転写時間は 4 ～ 8 時間に増加。
c) 長い転写産物（>1000 nt）の場合、転写には線状化プラスミドテンプレートの使用が推奨されます。
d) 反応溶液が長時間蒸発するのを防ぐため、PCR 装置内での反応は熱い蓋を開けた状態で行います。
e) 反応生成物に白い沈殿物が生じる場合があります。これは、反応中に遊離ピロリン酸とマグネシウムイオンによって形成されたピロリン酸マグネシウムであり、その後の実験には影響しません。EDTA を追加して除去できます。EDTA の追加がその後の実験に影響することを懸念する場合は、遠心分離によって上清を回収することもできます。
f) 試薬および容器は RNase 汚染があってはなりません。

5.3 37℃で2時間培養する

上記の反応溶液を混合し、チューブの底に軽く遠心分離し、37°C​​ で 2 時間インキュベートします。転写産物の長さが 100 nt 未満の場合は、反応時間を 4～8 時間に増やします。

5.4 DNase I処理（オプション）

反応が完了したら、各チューブに 2 μL の DNase I (RNase フリー) を加え、37°C​​ で 15 分間インキュベートしてテンプレート DNA を除去します。

6. よくある質問

6.1 IVT反応の収率は低い

テンプレートの品質は収量と密接に関係しています。実験グループの収量が陽性対照グループの収量よりも大幅に低い場合、考えられる理由は次の通りです。
① テンプレートにはIVT反応を阻害する成分が含まれています。
② テンプレートに問題があります。

6.2 提案

①テンプレートを再精製する。
②テンプレートの濃度と完全性を確認します。
③反応時間を延ばす。
④テンプレートの入力を増やします。
⑤他のRNAポリメラーゼと対応するプロモーターを試してください。

6.3 短いトランスクリプトの収量が低い

ターゲット転写産物が 100 nt より短い場合は、反応時間を 4 ～ 8 時間に延長するか、20 μL 反応システムでテンプレートの入力を 2 ug に増やします。

6.4 予想外に長いトランスクリプトがある

ゲル電気泳動の結果、予想外に長い転写産物があることが示された場合、考えられる理由は次のとおりです。
① プラスミドテンプレートが完全に直線化されていない可能性があります。
②テンプレートには3フィートのオーバーハングを持つ凝集端があります。
③転写産物は完全に変性していない二次構造を持つ。

6.5 提案

①プラスミドテンプレートが完全に直線化されているかどうかを確認します。必要に応じて、プラスミド直線化を再度実行します。
②適切な制限酵素を選択してプラスミドテンプレートを線状化し、3'オーバーハングのある付着末端の生成を回避します。必要に応じて、クレノウフラグメントまたはT4 DNAポリメラーゼを使用して平滑末端を生成することもできます。
③変性ゲルを用いて転写産物を検出します。

6.6 予想外に短いトランスクリプトがある

ゲル電気泳動の結果、予期しない短い転写産物があることが示された場合、考えられる理由は次のとおりです。
①テンプレート中にT7 RNAポリメラーゼの終結配列に類似した配列が存在する。
②テンプレートのGC含有量が高い。

6.7 提案

①反応温度を下げる（30℃など）が、反応温度を下げると収量が低下する場合があるので注意する。
②IVT反応を触媒するために他のRNAポリメラーゼを試してください。
③テンプレートのGC含量が高い場合は、IVT反応温度を42℃に設定するか、IVT反応系にSSBを添加して、転写産物の収量と長さを増加させます。

6.8 ゲル電気泳動中に転写産物がスメアリングする

ゲル電気泳動中に転写産物がにじむ場合、考えられる原因は次のとおりです。
①実験操作中にRNase汚染が発生する。
②DNAテンプレートがRNaseに汚染されている。

6.9 提案

①すべての試薬がRNaseフリーのH2Oで調合されていることを確認してください。実験操作中はRNaseフリーのピペットチップとエッペンドルフチューブを使用し、使い捨てのラテックス手袋とマスクを着用してください。
②DNAテンプレートを再精製する。

7. 注文情報

以下は Yeasen が提供する代表的な製品です。その他のサイズもご用意しています。当社の製品は連携して動作するように高度に最適化されており、優れたパフォーマンスと再現性を保証します。
カスタマイズされたサービスも提供できます。表示されていない製品にご興味がある場合は、お問い合わせください。お客様のニーズにお応えできるようお手伝いいたします。

表2. 製品情報

 

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