コンカナバリンAコーティング磁気ビーズについて

この記事では、コンカナバリン A の応用と、磁気ビーズとの共有結合について説明します。

パート1.コンカナバリンA

コンカナバリン A コーティング磁気ビーズ (ConA ビーズ) は、その名前が示すように、植物レクチン コンカナバリン A (ConA) が超常磁性ナノ材料と結合した生体磁気ビーズです。以下は、ConA 磁気ビーズの簡単な紹介です。

コンカナバリン A (ConA) は、血液型特異性のない植物レクチンタンパク質であり、1936 年以来、カトルビーン (Canavalia ensiformis、Pennisetum maritimum) から分離、精製、結晶化された最初の植物レクチンタンパク質です。

ConAは、存在する溶液のpHに応じて、α-2ホモ二量体またはα-4ホモ四量体の2つの主要な形態をとる[2] 。アルカリ性条件（pH> 7.0）では四量体（分子量26 kDaのサブユニット4つで構成）として存在し、酸性条件（pH 4.5-5.5）ではConAは活性化二量体構造（52 kDa）に解離する。さらに、ConAの機能は二価カチオンによって影響を受け、例えば金属イオン（Ca 2+およびMn 2+ ）が存在しない場合には、その立体配座および糖タンパク質結合機能は実現されない[ 1 ] 。

図（1）。（A）ConAモノマー、（B）ConAダイマー、（C）マンノース、グルコース、金属イオンを含むConAテトラマーの分子モデリング。

パート2. ビーズ

生体磁気ビーズは、ポリマーと無機磁性ナノ粒子によって形成された、粒子サイズがナノメートルの磁性マイクロスフィアの一種です。磁性ビーズは、その構造によって、コアシェル型、サンドイッチ型、拡散型という 3 つの主なカテゴリに分類できます。磁性材料には、純鉄粉、カルボニル鉄、磁性鉱石、オルトフェライト、鉄コバルト合金などがあります。

磁性ナノ材料は、小サイズ効果、表面効果、量子サイズ効果などの特殊効果により、Fe 3 O 4ナノ粒子のサイズが30 nm未満の場合、ナノ粒子内部の熱擾乱の干渉が顕著になり、このとき、これらのナノ粒子は特殊な磁気特性、すなわち超常磁性を示します。超常磁性 Fe 3 O 4ナノ粒子は、無毒性、良好な生体適合性、独特の磁気標的特性、交流磁場での発熱のしやすさなどの高品質の特性により、バイオ産業で広く使用されています。

対照的に、生体分子の固定化のために ConA とマイクロスフェアを共有結合させると、次のような利点があります。

  • 再現性のための共有結合結合の高い安定性。
  • 標的分子との相互作用のためにマイクロビーズ表面に結合したリガンド ConA。
  • 生物学的実験操作に適した溶液環境の速度論的特性評価；

パート3. ConA磁性ビーズの応用

文献で報告されているように、ConA 磁気ビーズの主な用途は、細胞質膜の分離、糖タンパク質の濃縮、固定化された細胞側​​面の分離という 3 つのシナリオに分類されます。

応用I: 細胞膜分離

二価カチオンの活性化の影響を受けてCa 2+およびMg 2+溶液環境で存在し、末端α-D-マンノシルとα-D-グルコシルの親和性相互作用の機能を持つConA磁性ビーズを使用して細胞膜を精製することは、シンプルで効率的な方法です。たとえば、細胞または組織の細胞膜分離は、細胞膜タンパク質をさらに得るための重要なステップです。ConAは細胞上のグリコシル化タンパク質に結合することができ、この原理を利用してより純度の高い細胞膜を得ることができます。主な操作手順は、ビオチン化ConAをストレプトアビジン磁性ビーズに結合させて磁性ビーズ上にConAを固定化すること、ConA磁性ビーズで細胞膜を1時間インキュベートすること、磁性ラックに吸着させること、TBSで5回洗浄すること、および溶出液で細胞質膜溶液を溶出することです[3] 。

図2. 細胞膜用ConA磁気ビーズ精製手順

応用 II: 糖タンパク質の濃縮

ConA はマンノースとグルコースに特異的で、多くの血清や細胞膜糖タンパク質の「コアオリゴ糖」である α 共役マンノースを認識します。そのため、免疫学では、細胞や組織の溶解物、または血清中の糖タンパク質などのグリコシル化分子を分離するために使用できます。

主な手順は、二官能性リンカーであるビス-N-ヒドロキシスクシンイミドリノレート（DSS）を介してアミノシラン化磁性ナノパール（MNP）をConAと架橋してConA磁性ビーズを得ること、メトキシエチレングリコール（MEG）を使用して磁性ナノパールの非特異的結合を終了し、磁気分離を行うこと、トリプシンで消化した細胞膜タンパク質の抽出物を添加してConA磁性ビーズと捕捉された糖ペプチドの両方をインキュベートし、最後に捕捉された糖ペプチドを溶出させ、真空乾燥することであった。ConA磁性ビーズの両方をインキュベートし、結合した糖タンパク質を持つConA磁性ビーズを磁気ラックで収集し、非糖ペプチドを洗浄し、最後に捕捉された糖ペプチドを溶出して真空乾燥させた。この方法により、腫瘍関連タンパク質（EGFRなど）の特定の糖化部位の詳細な分析が可能になります[4] 。

図3. 異なるレクチンに結合した超常磁性ナノ粒子

応用III: 固定化細胞の分離

ConA 磁性ビーズ（高純度のコンカナバリン A に共有結合した磁性ビーズ）を細胞膜または核膜上の糖タンパク質に結合させて細胞または核を捕捉することにより、少数の細胞に対する実験操作を可視化することができます。例えば、ConA 磁性ビーズは、クロマチンの構造と機能を研究する新しい技術である CUT&Tag および CUT&RUN [5]実験で使用され、操作を可視化し、遠心分離による細胞損失の問題を回避するために、細胞に ConA 磁性ビーズを結合させて固定化します。

DNA-タンパク質相互作用を研究するための従来の ChIP-seq 技術と比較して、CUT&Tag と CUT&RUN には次の利点があります。

  • ConA 磁性ビーズは細胞膜糖タンパク質に結合して操作を視覚化し、実験操作体験を向上させます。
  • 遠心分離の必要がなく、磁気ラックに吸着した ConA 磁気ビーズだけで細胞サンプルと溶液の分離が完了します。
  • わずか 10 個の細胞で操作できるため、ChIP-seq に多数のサンプルを用意する必要がありません。

図4. ChIP-seq、CUT&Tag、CUT RUN実験フローの概略図

パート4. YEASENコンカナバリンAコーティング磁気ビーズ

YEASENが開発したConA磁性ビーズは、厳格な原材料の選択と複数のプロセスの最適化と改善を経て、糖タンパク質、糖脂質、多糖類、および糖鎖修飾されたその他の分子に、迅速、効率的、高感度、特異的に結合することができます。主に細胞分離、または細胞や組織の溶解物や血清中の糖タンパク質などの糖鎖分子の分離に使用され、特にCUT&RUNやCUT&Tag（ChIP-seq実験の革新的な技術）などの実験に直接使用されます。

1.製品の特徴

  • 安定したバッチ生産と結果の再現性の向上。
  • 安定したパフォーマンスのストレージ
  • 細胞捕捉効率>90%

2.製品情報

猫NO.

カタログ番号 19810ES

サイズ

1mL/5mL/20mL

色

茶色がかった黄色

ビーズ濃度

10mg/mL

充実した内容

9～11mg/mL

ビーズサイズ

1µm

容量

10 5細胞/µLビーズ

3.製品性能データ

（１）単分散性

同じ処理条件および 10×/40× の倍率では、ConA ビーズは基本的に単分散であり、競合製品と比較して明らかな凝集は観察されませんでした。

YEASEN 原材料ビーズ

競合他社のConAビーズ

YEASEN ConAビーズ（品番19810）

図5. 単分散性の結果のグラフ

（２）ConAビーズ結合細胞の効果

同じ数の細胞を同じ時間ビーズとともにインキュベートし、ConA ビーズの結合後に残っている細胞の数を細胞分析装置で自動的に検出したところ、YEASEN ConA ビーズ (Cat#19810) が競合他社の製品よりも優れていることが示されました。

細胞懸濁液

競合的ConA磁気ビーズの結合後に残った細胞

YEASEN ConA磁気ビーズの結合後に残った細胞

図6. ConA磁性ビーズ結合細胞の写真

（３）細胞結合数と再現性

10µL YEASEN ConA ビーズ (カタログ番号 19810) と 10µL 競合 ConA ビーズはどちらも、競合製品と同等の E7 レベルの細胞数を結合します。繰り返し操作による細胞捕捉率は 90% を超えました。

図7. ConAビーズ結合細胞数と捕捉率の結果

（4）加速安定性

1mL/チューブで分注します。保管条件は、4℃、37℃加速処理で2、4、7、11、14日間、-20℃破壊処理で1、3、6、8日間でした。結果は、同じ実験条件下で、4℃で保管、37℃で加速処理、-20℃で破壊処理した製品の細胞捕捉率が95％を超え、各処理条件下での3つの反復グループのCV値が1％以内であり、良好な再現性を示しました。

図8. 異なる温度と時間におけるConAビーズの細胞捕捉率と再現性バイアスの結果

注文情報

コンカナバリンAコーティング磁気ビーズ

19810ES

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