NGSにおけるさまざまな種類の磁気ビーズ: DNA\RNA\mRNA磁気ビーズ
磁気ビーズは、ハイスループットシーケンシングライブラリの構築に必要な製品の1つです。DNAまたはRNAを精製し、ターゲットサイズのDNA断片をスクリーニングし、ターゲット核酸を濃縮することができます。シーケンシング技術の発展に伴い、DNA精製磁気ビーズ、DNAサイズ選択磁気ビーズ、RNA精製磁気ビーズ、mRNA濃縮磁気ビーズなど、さまざまな応用分野に特化した磁気ビーズが登場しました。では、さまざまな磁気ビーズの原理は何ですか？どのように選択すればよいですか？
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1. DNAビーズ
2. スターDNAビーズの紹介
3. RNA精製ビーズ
4. mRNA濃縮磁気ビーズ
5.
1. DNAビーズ
1.1 基本原則
磁気ビーズによる核酸の精製の原理は、固相可逆固定化（SPRI）に基づいています。特定の条件下では、核酸は磁気ビーズに選択的に結合しますが、汚染物質は溶液中に残ります。磁場を適用した後、ターゲット分子と結合した磁気ビーズは溶液から分離され、その後、磁気ビーズが洗浄されて汚染物質がさらに除去されます。磁気ビーズと核酸分子の組み合わせは可逆的であるため、低塩緩衝液で磁気ビーズから核酸を溶出できます。
磁性ビーズの外表面は、シリコンヒドロキシル基またはカルボキシル基で修飾されています。PEGと高塩イオンを含む精製緩衝液システムでは、DNA塩イオンカルボキシル基のイオンブリッジを形成することにより、DNAがビーズに結合します。この結合は可逆的です。PEGと塩イオンを含まないTE緩衝液ではイオンブリッジが除去され、最終的にDNAが精製されます。カルボキシル磁性ビーズに基づいて、異なる磁性ビーズ入力と精製緩衝液は異なる断片サイズに結合します。磁性ビーズはDNAの大きな断片に優先的に結合するので、第1ラウンドでは、磁性ビーズを使用してターゲット断片よりも大きい断片に結合し、上清を保持します。第2ラウンドでは、磁性ビーズが上清中のターゲット断片に結合し、上清を捨てます。最後に、ターゲットサイズのDNA断片が磁性ビーズから溶出されます。
図1.カルボキシル磁性ビーズ構造
図2. DNA精製磁気ビーズの原理
1.2 操作プロセス
図3. DNA精製手順
図4. DNAサイズ選択手順
1.3 磁気ビーズの使用に関するヒント
収量の向上と正確なサイズ選択
（１）使用前によく混ぜ、磁性ビーズを室温に少なくとも30分間置いて平衡化させる。
——磁気ビーズ緩衝液中のPEGの溶解度はpHと温度の影響を受けやすい。使用前に室温に戻して磁気ビーズを均一に懸濁させ、PEGを完全に溶解させて吸着・分離効果に影響を与えないようにする必要がある。
（２）吸着時間は十分であり、吸着が適切に行われるように十分に混合する必要がある。
（３）精製または分離中に８０％エタノールで洗浄すること。
——80%エタノール下では核酸は脱水され、密集しており、溶解しません。システム内の残留酵素、緩衝液、不純物などをエタノールで洗浄し、より純粋なライブラリを取得します。
（4）サイズ選択時に、サンプル量を確認し、磁気ビーズ添加比率が正しいことを確認する。
——サイズ選択時には、バッファー内の PEG と塩イオン濃度の変化が結果に影響を及ぼす可能性があるため、割合が正確になるように、対応する磁気ビーズの量を正確に入力する必要があります。
（５）溶出工程の前に、アルコールを完全に揮発させるが、ビーズが過度に乾燥しないようにする。
——通常は2〜3分で乾燥できます。磁性ビーズの数が多く乾燥しにくい場合は、複数の遠心管で操作することをお勧めします。
（６）磁性ビーズが凝集または板状になっている場合は、十分に混合した後、溶出時間を延長することができる。
——DNA に不純物が含まれているか、乾燥時間が長すぎることが原因である可能性があります。一般的に、DNA に不純物が多い場合は、サイズ選択の前にまず精製することをお勧めします。
2. スターDNAビーズの紹介
Hieff NGS™ DNA選択ビーズは、SPRI（固相逆固定化）の原理に基づいており、輸入磁性ビーズ原材料と最適化されたバッファーシステムを使用しており、NGSライブラリの構築中にDNA断片サイズの選択と精製に使用できます。使用されているAMPure XPビーズと同じように使用され、断片回収効率とライブラリサイズ分布はそれらと非常に一致しています。
2.1 浄化性能の紹介
- 独自のバッファーシステム: 50bp までの DNA 断片を回収できます。
- 高い回復率: ≥90%。
- 不純物を効果的に除去：プライマーダイマー、dNTP、無機塩、タンパク質などの不純物を効果的に除去します。
- 幅広い応用範囲: 酵素消化、ライゲーション、クローニング、NGS ライブラリ構築などのシナリオでの DNA 精製に適しています。
表1. 異なる比率の磁性ビーズによるDNAの精製と回収効率
| エクスペリエンスグループ | このバッチの磁性ビーズの回収濃度(ng/μL) | 回復率 | AMPure XP ビーズ グループ (ng/μl) ④ | 回復率 | CV% | |||
| 比率 | ① | ② | ③ | 平均 | ||||
| 1.8倍 | 22.2 | 23.4 | 22.8 | 22.8 | 96.92% | 22.2 | 94.37% | 2.55% |
| 0.8× | 20.2 | 19.3 | 18.5 | 19.33 | 82.19% | 17.8 | 75.67% | 6.52% |
| 0.6× | 16.3 | 17.3 | 16.8 | 16.8 | 71.42% | 16.2 | 68.87% | 2.55% |
図5. 磁気ビーズアガロースゲル電気泳動結果の精製効果
M：1kb DNAラダー;
2.2 サイズ選択性能
- 操作が簡単：分離原理と実験操作はXP磁気ビーズと完全に一致しています。
- 正確なサイズ選択：選別された断片のサイズは正確で安定しています
- 幅広い適用性: DNAおよびRNAライブラリの構築や、さまざまなサンプルタイプのフラグメントサイズ選択への適応に適しています。
- 超高コストパフォーマンス：安定した品質、より経済的な価格、より配慮のある販売前およびアフターサービス
図6. DNAサイズ選択結果
3. RNA精製ビーズ
Hieff NGS™ RNAクリーナーはSPRI原理に基づいており、タンパク質、塩イオン、その他の不純物を効率的に除去して高純度の濃縮RNAサンプルを取得し、酸性バッファーシステムを慎重に最適化してRNA構造の安定性を維持し、RNAの劣化を防ぎます。RNAライブラリの構築、rRNA除去後の全RNAサンプルの精製、in vitro転写RNA製品の精製、RNA標識製品の精製、合成RNAの精製などに適しています。
- 高品質：輸入原材料、非常に安定した品質
- 最適化されたバッファーシステム：RNAの純度と完全性を確保し、RNAの劣化を効果的に防止します。
- 高効率：効率的な回収、RNA ライブラリ構築や in vitro 転写産物回収などに適しています。
図7. 精製後のさまざまなサンプルの電気泳動図
4. mRNA濃縮磁気ビーズ
4.1 mRNA分離の原理
mRNA分離・濃縮用磁気ビーズは、表面をオリゴ（dT）で修飾した磁気ビーズです。ハイブリダイゼーションの原理により、ポリAテールを持つmRNAに特異的に結合し、全RNAまたは組織細胞からmRNAを特異的に分離します。最適化された製品配合のこのキットは、動物、植物、昆虫、真核微生物の細胞や組織のRNAから高純度の完全mRNAを効率的に分離できます。
図8. mRNA磁気ビーズの濃縮と精製の原理
4.2 mRNA分離ビーズの性能
Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit は、
- 高効率：mRNAの精製は45分以内に完了します
- 高純度：オリゴ（dT）磁気ビーズはmRNAに特異的に結合します
- 信頼性：得られたmRNAはNGS、in vitro翻訳、RT-PCR、cDNA合成に適しています。
図9. さまざまなRNAサンプルからのmRNA分離キットによるmRNAの精製
注: ハウスキーピング遺伝子収量はmRNA回収の効果を表します。rRNA関連遺伝子収量特性rRNA除去効率
4.3 mRNA磁気ビーズに関するFAQ
（１）磁性ビーズはなぜ凝集するのか、そしてそれをどう解決するのか？
——磁気ビーズの凝集により、mRNAの収量と純度が低下します。サンプルには、多糖類、タンパク質、長鎖DNAなどの多くの不純物が含まれている可能性があります。これらの不純物は磁気ビーズの凝集につながります。解決策は、磁気ビーズをピペットで吹き飛ばすことです。ゲノムDNAは、精製前にDNase処理で除去できます。最初のサンプルサイズが大きすぎて磁気ビーズの負荷を超えると、磁気ビーズも凝集します。マニュアルの入力量に従って操作することをお勧めします。
（２）なぜmRNA収量が低いのか？
——mRNA 収量が低い理由は多数あります。
- 細胞や組織の mRNA 発現レベルは低いため、適切な発現期間のサンプルを選択したり、サンプルの総 RNA 入力量を適切に増やしたりすることができます。
- 磁気ビーズとサンプルの比率が低すぎるため、mRNA と磁気ビーズの組み合わせに影響します。磁気ビーズの数を増やすか、サンプルの入力量と体積を減らしてください。
- ハイブリダイゼーション時間が短すぎる場合は、インキュベーション時間を 10 ～ 15 分に増やすことができます。
- 溶出が不十分な場合は、溶出バッファーの容量を適切に増やすか、溶出時間と温度を上げるか、溶出ステップを 2 回繰り返す必要があります。
（３）rRNAを効果的に除去するには？
——操作が不適切だと、特に総RNA入力量が多い場合、精製中にrRNAがmRNAとともに磁気ビーズに非特異的に結合してしまいます。精製プロセスでは通常、2回の結合が行われ、rRNA汚染を効果的に回避します。洗浄実験中に完全に混合されていることを確認し、非特異的結合を除去し、rRNA汚染を除去するようにしてください。
（4）多くの下流アプリケーションでは、mRNAを溶出する必要がありますか？また、磁気ビーズは下流の酵素反応を妨害しますか？
——RNAライブラリ構築におけるmRNAの断片化や逆転写など、一部の下流反応は、mRNAを溶出せずに磁気ビーズで直接行うことができます。ただし、PCR反応を行う場合は、ゲノムDNAの汚染がないことを確認する必要があります。そうでないと、多くのゲノム増幅断片が生成され、実験結果に干渉します。詳細な操作は、RNA-Seqライブラリ構築など、対応する下流反応の指示に従って実行できます。
（５）このキットは細胞や組織から直接mRNAを分離できますか？
——お勧めしません。ライセートには、mRNA の結合に影響を与える成分が含まれています。特別なキットを使用することをお勧めします。
5. Yeasen 磁気ビーズ製品の推奨
表2.
| 製品名 | 猫＃ | 仕様 | 使用および適用シナリオ |
| Hieff NGS™ DNA選択ビーズ | 12601ES03 | 1mL | 👉NGS DNAの精製とサイズ選択 👉PCR産物の精製 👉酵素消化および連結産物の精製 |
| 12601ES08 | 5mL | ||
| 12601ES56 | 60mL | ||
| 12601ES75 | 450mL | ||
| Hieff NGS™ RNAクリーナー | 12602ES03 | 1mL | 👉RNAの精製 👉rRNA除去後の全RNAサンプルの精製 👉RNA標識製品の精製 |
| 12602ES08 | 5mL | ||
| 12602ES56 | 60mL | ||
| 12602ES75 | 450mL | ||
| Hieff NGS™ mRNA 分離マスターキット | 12603ES24 | 24 トン | 👉mRNAの分離と精製 👉in vitro転写mRNA精製 |
| 12603ES96 | 96 トン |
読書について
NGS関連の技術について、どれくらいご存知ですか？
DNA選択ビーズの過去と現在を理解するための5分（結果分析とFAQの解釈を含む）