HEK293 宿主細胞残留 DNA フラグメント分析キットは、生物学的製剤の中間体、半製品、最終製品に含まれるさまざまな長さの HEK293 残留 DNA フラグメントの定量分析用に設計されています。このキットは、qPCR 蛍光プローブの原理を利用して、200 塩基対未満と 200 塩基対を超える HEK293 DNA 残基を特異的かつ迅速に検出します。定量限界は 10 fg/μL と低くなっています。また、HEK293 DNA コントロール (DNA 定量リファレンス) も含まれています。このキットは、同社の磁気ビーズベースの残留 DNA サンプル調製キット (カタログ番号 18461ES /18462ES) と併用できます。

製品情報

成分

保管と配送:

1.すべてのコンポーネントはドライアイスで出荷され、受領後は -25°C ～ -15°C で保管する必要があります。保存期間は 2 年です。コンポーネント A および B1、B2、B3、B4 は、光を避けて保管する必要があります。

2.受け取ったら、7 つのコンポーネントがすべて揃っていることを確認し、すぐに推奨温度で保管してください。

予防：

1.この製品は研究目的のみに使用されます。

2. 安全と健康上の理由から、操作中は実験着と使い捨て手袋を着用してください。

3.この試薬を使用する前に、取扱説明書をよくお読みください。サンプルの取り扱い、反応混合物の調製、ピペッティングなど、標準の手順に従って実験を実施してください。

4.各成分は使用前に軽く振ってよく混ぜ、軽く遠心分離してください。

対応機器:

以下の機器を含みますが、これらに限定されません。 Thermo Scientific: ABI 7500、ABI Quant Studio 5、ABI Step OnePlus 、 Bio-Rad: CFX96 光学モジュール、 Shanghai Hongshi Medical Technology: SLAN-96S

使用方法

 1. HEK293 DNAコントロール定量参照の希釈と標準曲線の作成

HEK293 フラグメント分析キットには、82 bp、133 bp、227 bp、515 bp の 4 つの異なる長さの増幅フラグメントが含まれています。標準曲線を確立するときは、増幅フラグメントごとに個別の曲線を設定し、対応する標準曲線に基づいて残留量と相対分布を計算します。

キットに付属の DNA 希釈バッファーを使用して、HEK293 DNA コントロール定量リファレンスの勾配希釈を実行します。希釈濃度は、3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、および 30 fg/μL にする必要があります。

詳細は以下の通りです

1 )キットのHEK293 DNAコントロールとDNA希釈バッファーを氷の上に置いて解凍します。完全に解凍したら、軽くボルテックスして混ぜ、短時間（10秒）遠心分離してチューブの底に溶液を回収します。

2 )清潔な1.5mL遠心管を6本用意し、Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5とラベルを付けます。

3 ) Std0 とラベルされたチューブに、DNA 希釈バッファー 90 μL と HEK293 DNA コントロール 10 μL を加えて、濃度を 3 ng/μL にします。軽くボルテックスして混ぜ、軽く遠心分離します (10 秒)。この濃度は小分けにして、-20°C で短期使用 (最長 3 か月) 用に保管できます。凍結融解を繰り返さないでください。

4 )。Std0 、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5 とラベルされたチューブに、まず DNA 希釈バッファーをそれぞれ 90 μL 加えます。各希釈ステップは、均一性を確保するために穏やかに混合し、短時間遠心分離する必要があります。 次にグラデーションを実行します 希釈は次の通りです。

表1: 標準勾配希釈

* 各濃度について、3 回繰り返します。この試薬は、300 pg/μL ～ 30 fg/μL の直線範囲内でテストできます。必要に応じて、直線範囲を適切に拡大または縮小できます。

** 凍結融解の繰り返しを減らし、汚染を防ぐために、初めて使用するときはDNA 定量標準液を小分けして -20°C で保存することをお勧めします。

*** 未使用の解凍した DNA 希釈液は、2 ～ 8°C で最大 7 日間保存できます。長期間使用しない場合は、-20°C で保存してください。

**** テンプレートが完全に混合されるように、各勾配希釈液を約 1 分間軽く振ってください。

2. 試験サンプル（TS）の調製

次のように、実験設定に従ってテストサンプル TS を準備します。

1) 試験サンプル100μLを採取し、1.5mLの清潔な遠心管に加える。TSとラベルし、サンプル前処理を行い、試験サンプルの精製を準備する。

2) 4つの異なる伸長長さを同時に分析するという要件を満たすには、前処理済みの試験サンプルの量は120μL以上である必要があります。したがって、前処理用に各サンプルを2本ずつ用意し、抽出後に混合して使用することをお勧めします。

3. ネガティブ抽出コントロール（NCS）の調製

次のように、実験設定に従ってネガティブ抽出コントロール NCS を準備します。

1) サンプルマトリックス溶液（または DNA 希釈バッファー）100 μL を採取し、1.5 mL の清潔な遠心チューブに加えます。NCS とラベルを付けます。

2) 試験サンプルのバッチと一緒にネガティブコントロール NCS のサンプル前処理を実行し、精製されたネガティブコントロール NCS 溶液を調製します。

3) 4つの異なる伸長長を同時に分析するという要件を満たすには、前処理済みのNCSサンプルの量は120μL以上である必要があります。したがって、前処理用に各NCSサンプルを2本ずつ用意し、抽出後に混合して使用することをお勧めします。

4. テンプレートなしコントロール（NTC）の準備

次のように、実験設定に従ってテンプレートなしのコントロール NTC を準備します。

1) ノーテンプレートコントロール（NTC）はサンプルの前処理を必要とせず、 qPCRを使用して残留DNA含有量を検出する段階から準備できます。

2) 各チューブまたはウェルの NTC サンプルは、20 μL のミックス (つまり、15 μL HEK293 qPCR ミックス + 5 μL の対応する HEK293 プライマー & プローブ ミックス) + 10 μL DNA 希釈バッファーで構成されます。3 つの複製ウェルに十分な量を準備することをお勧めします。

5. qPCR反応システム

表2 . 82 bpフラグメントの反応システム

表3 . 133 bp断片の反応システム

表4 . 2 2 7 bpフラグメントの反応システム

表5 . 515bp断片の反応系

* ウェルの数に基づいてこの反応に必要なミックスの総量を計算するには:

ミックス = (反応ウェルの数 + 2) × (15 + 5) μL (2 つのウェルの損失を考慮)。通常、サンプルごとに 3 つの複製ウェルが準備されます。

** 反応ウェルの数 = (5 つの濃度勾配標準曲線ウェル + 1 つのテンプレートなしコントロール (NTC) + 1 つのネガティブコントロール溶液 (NCS) + N 個のテストサンプル (TS)) × 3。

NTC (テンプレートなしコントロール): DNA希釈バッファー

NCS (ネガティブコントロール溶液): サンプル前処理後のサンプルマトリックス溶液または DNA 希釈バッファーで精製された溶液、つまり NCS が得られます。

TS (テスト サンプル): テストするサンプル。

***サンプルを分注してチューブを密封した後、低速で短時間（10 秒）遠心分離し、チューブの壁から底に液体を集めます。次に、少なくとも 5 秒間ボルテックスして完全に混合します。その後、もう一度低速で遠心分離（10 秒）します。気泡がある場合は、必ず除去してください。

表6: 参照プレートのレイアウト

この例では、残留 HEK293 DNA の増幅フラグメントを分析するための qPCR 検出手順を示します。テスト サンプルには、HEK293 DNA 標準曲線の 5 つの濃度勾配、1 つのテスト サンプル (TS)、1 つのネガティブ コントロール ソリューション (NCS)、および 1 つのテンプレートなしコントロール (NTC) が含まれます。各サンプルに対して 3 つの複製ウェルを実行することをお勧めします。

6. 増幅プログラムパラメータ（3ステップ方式） （ABI 7500 qPCR装置、ソフトウェアバージョン2.0を使用した例）**

1) 新しい空のプログラムを作成し、検出テンプレートとして「絶対定量」を選択します。

2) 4 つの異なる増幅フラグメント長に対して、新しい検出プローブを作成し、「HEK293-82」、「HEK293-133」、「HEK293-227」、「HEK293-515」という名前を付けます。レポーター蛍光体として「FAM」、クエンチャー蛍光体として「なし」を選択します。検出用の参照色素を「ROX」に設定します (参照色素は、機器モデルやその他の要因に応じて追加される場合とされない場合があります)。

3) 「選択したウェルにターゲットを割り当てる」パネルで、標準曲線ウェルの「タスク」フィールドを「標準」に設定し、「数量」フィールドの対応する値を「300000」、「30000」、「3000」、「300」、「30」（ウェルあたりの DNA 濃度を fg/μL で表す）に割り当てます。「サンプル名」フィールドで、ウェルに「300 pg/μL」、「30 pg/μL」、「3 pg/μL」、「300 fg/μL」、「30 fg/μL」と名前を付けます。NTC ウェルの場合は、「タスク」を「NTC」に設定します。NCS および TS ウェルの場合は、「タスク」を「不明」に設定し、「サンプル名」フィールドでウェルに「NCS」および「TS」と名前を付けます。これらのパラメータを設定したら、「実行開始」をクリックして、機器の実行を開始します。

4) 増幅プログラムの設定：反応容量を30μLにして、3段階の増幅プログラムを設定します。

表7. PCR手順

7. qPCR結果の分析

1) 「増幅プロット」の「分析」パネルでは、システムが自動的に「しきい値」を設定します。デフォルトの「しきい値」がベースラインに近すぎると、反復間で Ct に大きなばらつきが生じることがあります。「しきい値」を適切な位置に手動で調整し、「分析」をクリックすることができます。この時点で、「マルチコンポーネント プロット」の増幅曲線が正常かどうかを事前に確認できます。

2) 「標準曲線」の下の「分析」パネルでは、標準曲線の R²、増幅効率 (Eff%)、傾き、切片を確認できます。通常の標準曲線の場合: R² > 0.99、増幅効率 (90% ≤ Eff% ≤ 110%)、傾きは -3.6 ～ -3.1 です。

3) 「ウェル テーブルの表示」の「分析」パネルでは、テンプレートなしコントロール (NTC)、ネガティブ コントロール (NCS)、テスト サンプル (TS) の「数量」列を fg/μL 単位で確認できます。単位はレポート内で後で変換できます。

4) 結果分析のパラメータ設定は、特定の機器モデルとソフトウェアバージョンによって異なります。通常、機器は結果を自動的に解釈できます。

5) ネガティブコントロール (NCS) の Ct 値は、標準曲線の最低濃度の平均 Ct 値よりも大きくなければなりません。

6) テンプレートなしコントロール (NTC) の結果は「未確定」であるか、Ct 値が 32 以上である必要があります。

書類

マニュアル