줄기세포 치료와 오르가노이드 기반 약물 개발의 발전으로 기저막 매트릭스는 줄기세포 배양 및 오르가노이드, 3D 세포 배양 및 혈관신생, 생체 내 종양 형성 실험 등을 포함한 기타 응용 분야에서 영양소 및 지지체 캐리어로서 중요한 역할을 합니다. Ceturegel™ 기저막 추출물은 라미닌, IV형 콜라겐, 네스틴 등을 포함한 세포외 매트릭스 단백질이 풍부한 Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) 마우스 종양에서 추출됩니다. IGF, FGF 및 기타 성장 인자. 실온에서 Ceturegel™ 기저막 매트릭스는 중합되어 생물학적으로 활성인 3차원 매트릭스를 형성합니다. 생체 내에서 세포 기저막의 구조, 구성, 물리적 특성 및 기능을 시뮬레이션할 수 있어 시험관 내에서 세포의 배양 및 분화에 유익하며 좋은 마트리겔 대체물입니다.

1. Ceturegel™ 기저막 매트릭스란 무엇입니까?
2. Ceturegel™ 기저막 매트릭스의 역할은 무엇입니까?
3. Ceturegel™ 기저막 매트릭스의 특징은 무엇입니까?
4. Ceturegel™ 기저막 매트릭스의 대중적 응용 분야
5. 자주 묻는 질문
6. Yeasen의 Ceturegel™ 기저막 매트릭스 선택 가이드

1. Ceturegel™ 기저막 매트릭스란 무엇입니까?

내피세포, 상피세포, 근육세포, 신경세포에 인접한 기질은 기저막이라 불리는 연속적이고 층상화된 세포외 기질을 형성한다. 기저막은 발생과 상처 치유 동안 퇴화되고 재생된다. 그것은 세포와 세포층을 지지할 뿐만 아니라 기저막의 기능인 세포 접착, 이동, 증식 및 분화에 영향을 미쳐 조직 형성에 중요한 역할을 한다. 따라서 기저막은 전이성 종양 세포의 침입에 대한 주요 장벽이라고 할 수 있다.

그림 1. Ceturegel™ 기저막 매트릭스

YEASEN에서 개발 및 생산한 Ceturegel™ 기저막 매트릭스는 LDEV(Lactate Dehydrogenase Enhancing Virus)를 포함하지 않으며 매우 낮은 엔도톡신 함량을 가지고 있습니다. 그리고 마이코플라스마 검출 후, 염기성 농도, 고농도, 저성장 인자 등 다양한 유형을 포함하여 마이코플라스마 오염이 없음을 보장합니다.

2. Ceturegel™ 기저막 매트릭스의 역할은 무엇입니까?

Ceturegel™ 기저막 매트릭스는 다양한 요구 사항의 기저막 매트릭스를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 마우스 신장 줄기 세포에 의한 신세관 형성에서 성장 인자의 역할 연구, 마우스 유방 상피 줄기 세포의 유전자 발현 연구, Transwell의 종양 침습성 실험과 같은 세포 신호 전달 연구에 사용할 수 있습니다. 동시에 세포 형태, 생화학적 기능, 이동, 감염 및 유전자 발현 연구에 사용할 수 있습니다. Ceturegel™ 기저막 매트릭스는 상피 세포 및 신경 세포, 줄기 세포, 포유류 상피 세포, 흑색종 세포, 혈관 내피 세포, 갑상선 세포 및 모낭 세포를 포함한 다른 유형의 세포의 부착 및 분화를 효과적으로 도울 수 있습니다. 동시에 Ceturegel™ 기저막 매트릭스는 쥐 유방 상피 세포의 단백질 발현 수준에 영향을 미치고 말초 신경 재생을 지원합니다.

그림 2. Ceturegel™ 기저막 매트릭스의 주요 적용 방향

세포 이동 및 침습에 대한 자세한 설명: 세포 이동은 세포 크롤링, 이동 또는 이동이라고도 하며, 세포가 이동 신호를 받거나 특정 물질의 기울기를 느낀 후의 이동을 말합니다. 세포 이동은 세포 머리의 유사족 확장, 새로운 접착 확립 및 세포체 꼬리 수축의 교대 과정입니다. 세포 이동은 정상 세포의 기본 기능 중 하나이며 신체의 정상적인 성장 및 발달의 생리적 과정이기도 합니다. 살아있는 세포의 유비쿼터스한 이동 형태로 다양한 집단적 생리적 및 병리적 과정에 참여할 수 있습니다. 예를 들어 배아 발달, 혈관 생성, 상처 치유, 면역 반응, 염증 반응, 죽상 경화증, 암 전이 등입니다. 반면 세포 침습은 세포가 세포 외 기질을 통해 한 영역에서 다른 영역으로 이동하는 능력을 말합니다. 세포 침습은 정상 세포와 암 세포가 화학적 및 기계적 자극에 반응하는 것입니다. 세포 침습은 종종 상처 치유, 혈관 생성, 염증, 종양 세포 전이 및 조직의 비정상적인 침윤 과정에서 발생합니다.

3. Ceturegel™ 기저막 매트릭스의 특징은 무엇입니까?

높은 안전성 : LDEV(젖산탈수소효소증가바이러스) 없음
농도 다양성 : 농도 범위는 8~20 mg/ml입니다.
우수한 배치 안정성 : 엄격한 생산 품질 검사 프로세스를 통해 배치 간 안정적인 성능 보장
낮은 엔도톡신 : 엔도톡신 함량 <8 EU/ml
오염 검출 : 마이코플라스마, 박테리아, 곰팡이 잔류물이 검출되지 않았습니다.
높은 단일 배치 출력 : 단일 배치 출력이 50L 수준 이상입니다.
호환성 : 모든 유형의 세포 배양 매체와 호환 가능

4. Ceturegel™ 기저막 매트릭스의 대중적 응용 분야

4.1 이주 및 침입 분석

세포 이동 및 침투 능력을 감지하는 실험 방법은 Transwell 실험이며, Transwell은 천공 실험이라고도 합니다. 챔버에는 기공이 빽빽하기 때문에 세포 현탁액을 먼저 챔버에 넣습니다. 그런 다음 챔버를 24웰 플레이트에 넣고 완전한 배지를 첨가했습니다. 세포는 변형되어 챔버의 구멍을 통해 영양분이 더 풍부한 챔버 외부로 이동하여 외부에 달라붙었습니다. 챔버 외부의 세포를 염색하고 계산하여 세포의 이동 및 침투 능력을 판단할 수 있습니다. Transwell의 원리는 작은 챔버를 배양판에 넣고 작은 챔버를 상부 챔버라고 하며 배양판을 하부 챔버라고 합니다. 배양액의 상부와 하부 층은 폴리카보네이트 막으로 분리되어 있으며, 배양액의 상부 층을 상부 챔버에 첨가하고 배양액의 하부 층을 하부 챔버에 첨가합니다. 세포는 상부 챔버에 있고 하부 배지의 구성은 막의 투과성으로 인해 상부 챔버의 세포에 영향을 미칩니다. 또한, 하부배지의 성분이 세포의 성장과 이동에 미치는 영향을 조사하였다.
이동 및 침투 검정에서 Ceturegel™ 기저막 매트릭스의 특정 작업: 희석된 Ceturegel™ 기저막 매트릭스를 Transwell의 상부 챔버에 넣고 세포를 도말하여 37°C, 5% CO ₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하고, 4% 파라포름알데히드에 고정하고, 0.1% 크리스탈 바이올렛 염색 용액으로 염색했습니다. 역위상차 현미경으로 세포를 관찰하고 계수했습니다.

그림 3. 세포 침투 후 크리스탈 바이올렛 염색 결과

4.2 혈관신생

1) 실험 하루 전, Ceturegel™ Matrigel을 냉동고에서 꺼내어 4°C 냉장고에 하룻밤 넣어 해동시키고, 사용된 소모품을 미리 식힙니다.
2) 실험 전에 Ceturegel™ Matrigel을 항상 아이스박스에 보관하십시오. 혈관신생 슬라이드의 멸균 포장을 열고 슬라이드를 꺼냅니다.
3) 각 웰에 10 μl Ceturegel™ Matrigel을 추가합니다. Ceturegel™ Matrigel을 추가할 때 피펫 팁이 내부 구멍의 상단에 수직이 되어야 Matrigel이 위쪽 구멍을 통해 흘러내려 접착제 잔여물이 남지 않도록 합니다.
4) 먼저 슬라이드를 덮고, 10cm 페트리 접시를 준비하고, 물에 적신 종이 타월을 넣어 젖은 상자를 만듭니다.
5) 슬라이드를 페트리 접시에 넣고 페트리 접시를 덮습니다. CO ₂ 인큐베이터에 넣고 약 30분 동안 방치한 후 젤이 응고될 때까지 기다린 다음 동시에 세포 현탁액을 준비합니다.
6) 소화된 세포를 2*10 ⁵ 세포/ml의 밀도로 세포 현탁액에 넣고 완전히 혼합합니다.
7) 젤로 응고된 혈관이 들어 있는 유리 슬라이드를 제거합니다. 각 웰에 세포 현탁액 50 μl를 넣고 피펫 팁을 위쪽 웰 위에 수직으로 유지하고 아래쪽 웰의 젤을 만지지 않도록 주의합니다.
8) 세포 배양 배지를 넣고 뚜껑을 닫은 후 그대로 둡니다. 시간이 지나면 모든 세포가 마트리젤 표면에 가라앉습니다.

그림 4. 혈관신생 결과 그래프

면역형광염색

1) 접착제나 세포망을 만지지 않고 웰에서 배지를 조심스럽게 꺼냅니다. 혈청이 없는 배지에서 칼세인을 최종 농도 6~8µg/ml로 희석합니다. 세포 염색 용액을 넣어 세포를 완전히 담그고, 어두운 곳에서 실온에서 30~40분 동안 배양합니다.
2) PBS로 3번 세척합니다. PBS는 세포에 충격을 주지 않도록 위쪽 웰에 천천히 첨가해야 합니다. Ex=485 nm, Em=529 nm 파장을 사용한 형광 관찰

그림 5. 혈관의 면역형광염색

4.3 3D 세포 배양

전통적인 세포 배양과 달리 3D 세포 배양은 세포의 생체 내 환경을 재현합니다. 단순한 구형체 모델조차도 단층 배양의 단점을 보완할 수 있습니다. 이러한 구조는 산소, 영양소, 대사산물 및 가용성 신호의 기울기를 형성할 수 있으며, 이는 다양한 세포 집단을 형성합니다. 3D 세포 배양 기술은 세포가 유기체에서 사는 자연 환경을 더 잘 시뮬레이션하여 세포와 생화학적 및 생리적 반응 간의 상호 작용을 보다 현실적으로 만들 수 있습니다. 3D 환경에서 세포의 내인성 및 외인성 자극에 대한 반응은 생체 내 반응과 더 유사합니다.
3D 세포 배양에서 Ceturegel™ 기저막 매트릭스의 구체적인 작동은 다음과 같습니다. Ceturegel™ 기저막 매트릭스를 조절된 농도의 단일 세포 HepG2 현탁액 1:1과 부드럽게 혼합하고, 위에서 혼합한 단일 세포 현탁액 50 μl를 미리 냉각된 피펫 팁으로 미리 냉각된 24-웰 플레이트에 첨가하여 아치 모양의 세포 방울을 형성한 후 37°C, 5% CO2 배양기에서 배양하고 매일 관찰하고 사진을 촬영했습니다.

그림 6. 3D 세포 배양 결과

표 1. 3D 세포 배양 Ceturegel™ 기저막 매트릭스 사용 참고:

참고사항: Ceturegel™ 기저막 매트릭스의 다양한 배치에는 특정 농도 차이가 있으며, 권장 복용량은 참고용일 뿐입니다.

4.4 생체내 종양형성 실험

누드 마우스에서 HepG2 세포의 피하 종양 형성 실험을 예로 들면, Ceturegel™ 기저막 매트릭스와 세포 현탁액을 1:1 희석하여 4-5주령의 BALB/c-nu 암컷 마우스에 피하 접종을 실시했습니다. 실험 과정은 다음과 같습니다.
♦ 약 80-90%의 대수적 성장과 세포 밀도를 갖는 HepG2 세포를 준비하고 세포를 채취하기 전날 밤에 새로운 배지로 교체합니다.
♦ 세포는 트립신에 의해 소화됩니다. 세포가 둥글게 되어 배양 접시를 떠나지 않을 때 트립신을 제거하고 혈청이 없는 배지를 첨가하여 세포 현탁액을 만들고 원심분리하고 한 번 세척하며 최종 농도는 5 × 10 ⁷ cells/mL입니다.
♦ 세포 현탁액과 Ceturegel™ 기저막 매트릭스를 1:1 비율로 4℃에서 희석하여 최종 농도가 5 × 10 ⁷ cells/mL가 되도록 준비합니다.
♦ 왼손으로 고정된 누드 마우스를 잡고 누드 마우스의 오른쪽 어깨에 피하 주사합니다. 접종하는 동안 바늘을 피하로 약간 더 깊이, 약 1cm 깊이로 삽입하여 주사 후 바늘 눈에서 세포 현탁액이 넘치는 것을 줄입니다.
접종량은 200 μL입니다. (이 과정은 가능한 한 30분 이내에 완료되어야 합니다. 도중에 세포 현탁액을 얼음 위에 두어 세포 사멸을 늦추고 겔 현상을 방지해야 합니다.)
♦ 누드 마우스를 다시 케이지에 넣어 계속 먹이를 주게 하면 종양은 약 1주일에서 1개월 동안 볼 수 있습니다. 실험 설계에 따라 종양 부피가 요구 사항에 도달하면 누드 마우스를 안락사시키고 사진을 찍습니다.

참고사항: 대조군은 배양배지와 세포의 현탁액이며, 최종농도는 매트릭스 접착제 시험군과 동일합니다.

4.5 오르가노이드 배양

오르가노이드는 줄기 세포에서 분화된 3D 다세포 미세 조직입니다. 장기의 일부 특성은 재현될 수 있습니다. 오르가노이드는 다세포이며 높은 수준의 자가 조립을 나타내므로 기존의 2D 배양보다 복잡한 생체 내 세포 반응과 상호 작용을 더 잘 나타낼 수 있습니다. 정상 또는 질병 조직의 줄기 세포 및/또는 장기 전구 세포는 Ceturegel™ 기저막 매트릭스 또는 콜라겐과 혼합할 수 있습니다. 신장, 갑상선, 간, 뇌, 폐, 장, 전립선 및 기타 미세 장기를 형성합니다. 예를 들어, 유전자 스크린을 수행하는 연구자의 경우 Ceturegel™ 기저막 매트릭스 기질을 바이오잉크로 사용하여 3D 바이오 프린팅에서 살아있는 세포/오르가노이드의 정확한 위치 지정 및 임베딩을 가능하게 할 수 있습니다.

그림 7. 오르가노이드 작동 과정

마우스 소장 기관체 구조

샘플 준비: 쥐의 목을 잘라 죽인 후 표면에 알코올을 뿌려 살균합니다. 멸균 환경에서 위 끝 근처 3~15cm의 장 조직을 잘라내고, 핀셋으로 장 외부의 장간막과 지방을 조심스럽게 제거한 후 4℃에서 예냉한 1% 이중 항체가 포함된 DPBS 용액에 넣습니다.

샘플 세척: 주사기를 사용하여 장관을 2~3회 세척한 후 수술용 가위를 사용하여 장관강이 위를 향하게 하여 장관을 조심스럽게 절단하고 수술용 칼날을 사용하여 장관강 표면의 장융모를 살짝 긁어냅니다. 장융모가 긁어내진 후(투명한 조직이 보임) 장 조직을 DPBS가 들어 있는 새로운 배양 접시에 2~3회 놓습니다.

샘플의 초기 처리: 세척한 소장 조직을 2mm 너비의 작은 조각으로 자른 다음, 새로운 50ml 원심분리관으로 옮깁니다. DPBS로 3~5회 부드럽게 세척하여 장 융모 세포와 떠다니는 지방 조직을 제거합니다.

샘플 소화: 세척한 소장 조각에 3-5mM EDTA가 함유된 미리 냉각된 DPBS 10-15ml을 첨가하여 소화하고, 약 30분간 4℃에서 배양하며, 이 기간 동안 10분마다 원심분리관을 가볍게 흔든다.

소화 후 EDTA 소화 용액의 상층액을 버리고, 새로운 DPBS 완충액으로 조직을 2~3번 가볍게 헹궈 남아 있는 EDTA를 제거합니다.

0.1% BSA를 함유한 미리 냉각된 DPBS 10-15ml를 소장 조직 조각에 넣고 조직 조각을 반복적으로 불어서 재현탁하여 움푹 들어간 부분과 기저층을 분리한 다음, 약간의 현탁액을 취하여 현미경 검사를 합니다. 움푹 들어간 부분과 같은 구조가 많이 보이면 불어내는 것을 멈추고 불어낸 조직 현탁액 μM ​​필터 스크린에 70%를 사용하여 필터 스크린을 통과하는 조직 현탁액을 여과하고 수집합니다.

5~6단계를 두 번 반복하고 1500rpm, 4℃에서 3분간 원심분리합니다.

혼합물 형성: Ceturegel™ 매트릭스 접착제 무거운 현탁액 움푹 들어간 조직 침전, 10 μL 매트릭스 접착제 현탁액마다 200~600개의 움푹 들어간 곳이 들어 있습니다. 재부유 후, 혼합물을 얼음 위에 놓고 가능한 한 빨리 작동시켜 매트릭스 접착제가 젤을 형성하는 것을 방지합니다.
참고사항: Ceturegel™이 배양 과정에서 기질 접착제 구조의 안정성을 유지하기 위해 기질 접착제의 희석 비율은 ≥ 50%여야 합니다.

혼합된 현탁액을 24-웰 플레이트 바닥 중앙에 30~50μL씩 좌우로 놓아서 현탁액이 오리피스 플레이트의 측벽에 닿지 않도록 합니다.

배양된 배양판을 37℃ 이산화탄소 항온배양기에 넣고, 매트릭스 겔이 굳을 때까지 약 30분 동안 배양합니다.

Ceturegel™을 기다리세요. 매트릭스 접착제가 완전히 굳은 후, 준비한 장내 기관 배양 배지를 웰당 800μL씩 벽면을 따라 천천히 첨가합니다.

24-well 플레이트를 37℃ 이산화탄소 인큐베이터에 넣어 배양합니다. 3일마다 새로운 배지를 교체하고 장기와 같은 장기의 성장 상태를 모니터링합니다. 일반적으로 쥐의 소장과 같은 장기는 5-7일 이내에 형성됩니다.

그림 8. 마우스 소장 유사 기관의 시험관 내 배양 결과

5. 자주 묻는 질문

1. 얻어진 기판의 색상 차이(연한 노란색에서 진한 빨간색)의 원인은 무엇입니까?
페놀 레드를 함유한 Ceturegel™ 기저막 매트릭스의 경우, 이는 주로 페놀 레드와 중탄산염이 CO ₂ 와 상호 작용하여 발생하지만, 5% CO ₂ 로 평형을 이룬 후에는 색상 차이가 감소합니다. 동결 및 해동 후 바이알을 가볍게 흔들어 Ceturegel™ 기저막 매트릭스를 고르게 분산시킵니다.
2. Ceturegel™ 기저막 매트릭스의 작동에 있어서 주의해야 할 사항은 무엇입니까?
모든 작업은 멸균 환경에서 수행해야 하며, 미리 냉각된 피펫을 사용하여 Ceturegel™ 기저막 매트릭스가 균질화되었는지 확인해야 합니다.
3. Ceturegel™ 기저막 매트릭스를 사용하기 위해 동결 및 보관하는 방법은 무엇입니까?
냉동 및 해동된 Ceturegel™ Matrix LDEV-Free Ceturegel™ 기저막 매트릭스는 여러 개의 작은 튜브에 분배할 수 있습니다. 모든 분배는 미리 냉각된 크리오바이얼에 담겨야 하며, 여러 번의 냉동 및 해동을 피하기 위해 빠르게 냉동하고 보관해야 합니다. 관련된 모든 품목은 사용하기 전에 미리 냉각해야 합니다. 미리 냉각된 피펫, 팁 및 작은 튜브를 사용하여 Ceturegel™ 기저막 매트릭스를 취급합니다.

6. Yeasen의 Ceturegel™ 기저막 매트릭스 선택 가이드

다양한 유형의 Ceturegel™ 기저막 매트릭스는 다양한 용도로 사용됩니다. 표준 농도의 Ceturegel™ 기저막 매트릭스는 상피 세포와 같은 극성 세포 배양에 사용할 수 있습니다. 다양한 세포의 분화를 촉진하고 종양 세포 이동 및 침습 실험에 사용할 수 있습니다. 고농도의 Ceturegel™ 기저막 매트릭스는 생체 내에서 널리 사용되며 세관 형성 실험에 사용할 수 있습니다. 저성장 인자(GFR)의 주요 기능은 실험에서 성장 인자의 간섭을 제거하는 것이며 기저막 제조에 대한 요구 사항이 높은 연구에 적합합니다. 페놀 레드가 없는 Ceturegel™ 기저막 매트릭스는 페놀 레드 지표의 간섭을 제거할 수 있으며 비색법 및 형광 검출과 같은 발색 실험에 적합합니다. 인간 배아줄기세포 배양 등급 Ceturegel™ 기저막 매트릭스는 인간 배아줄기세포 배양, 유도 다능성 피더 없는 줄기세포 배양에 특별히 사용됩니다. Yeasen은 다양한 유형의 Ceturegel™ 기저막 매트릭스를 제공하므로 실험에 따라 선택할 수 있습니다.

표 2. Ceturegel™Matrix 선택 가이드

제품 유형	카탈로그 번호	제품 이름	마트리젤 카탈로그 번호	신청방향
기본 농도 (8-12 mg/ml)	40183ES	Ceturegel™Matrix LDEV-Free	356234/ 354234	2D 및 3D 배양, 침습 및 이동 실험에 적용 가능하며 생체 내 종양 형성 실험에도 사용 가능
	40184ES	Ceturegel™Matrix Phenol Red-Free, LDEV-Free	356237	주로 형광 검출 실험 등의 색상 검출에 사용
성장인자 감소	40185ES	Ceturegel™Matrix GFR, LDEV 없음	354230	주로 실험에서 성장인자의 간섭을 배제하기 위함입니다. 성장인자, 신호전달 경로 등에 대한 관련 연구에 적용
	40186ES	Ceturegel™Matrix GFR, 페놀 레드 무첨가, LDEV 무첨가	356231
고농도 (≥18mg/ml)	40187ES	Ceturegel™Matrix 고농축, LDEV 없음	354248	주로 혈관신생, 겔색전술, 생체내 종양형성 등의 실험에 사용(혈관신생의 경우 Ceturegel™ 기저막 매트릭스의 최종 농도가 ≥10mg/ml인 것이 권장됨)
	40189ES ( 문의 )	Ceturegel™Matrix 고농도, GFR, LDEV 없음	354263
	40188ES	Ceturegel™Matrix 고농축, 페놀 레드 무첨가, LDEV 무첨가	354262
줄기세포를 위해	40190ES	Ceturegel™Matrix hESC 인증, LDEV 없음	354277	주로 hESC, iPSC 등 줄기세포 배양에 사용됩니다.
오르가노이드 특정	40191ES ( 문의 )	Ceturegel™ 오르가노이드 배양용 매트릭스, 페놀 레드 무첨가, LDEV 무첨가	356255	오르가노이드 배양을 위한 Ceturegel™ 기저막 매트릭스