Beste vrienden, voelt u zich verloren wanneer u geconfronteerd wordt met verschillende Loading Control en Epitope Tagging Antibodies tijdens proteïne immunoblotting? eiwitten worden gecodeerd door housekeeping-genen in organismen en worden stabiel tot expressie gebracht in meerdere weefsels. Ze worden gebruikt om te verifiëren of immunologische experimenten normaal verlopen en als een semi-kwantitatieve detectiestandaard voor eiwitexpressie. Dus, hoe kiest u correct laadcontrole-antilichamen? U kunt verwijzen naar de volgende punten.
I. Herkomst van de monstersoort
- Voor monsters van zoogdierweefsels of -cellen kiest u over het algemeen voor β-actine, α-tubuline, GAPDH, lamin-B, histon H3, Na+/K+-ATPase.
- Voor monsters afkomstig van planten kiest u over het algemeen voor plantaardige actine, Rubisco, enz.
- Voor andere monsters waarvoor minder onderzoek nodig is, kiest u het juiste eiwit als interne referentie door relevante literatuur of databases te raadplegen.
Zorg ervoor dat het molecuulgewicht van het doelproteïne verschilt van dat van de laadcontrole met meer dan 5KDa om interferentie tijdens detectie te voorkomen. Als het doeleiwit bijvoorbeeld 40KDa is, is het niet geschikt om β-actine (42KDa) als laadcontrole te kiezen. Overweeg om GAPDH (36KDa) of β-tubuline (55KDa) als laadcontrole te gebruiken.
III. Expressieplaats van het interne referentie-eiwit
Let op: Vermijd de volgende situaties bij het gebruik van laden controle antilichamen
| Subcellulaire lokalisatie | Laden Controle Proteïne | Moleculair gewicht (KDa) | Notities |
| Cytoplasma, hele cel | β-actine | 42 | Niet geschikt voor nucleaire extracten. β-actine is een component van chromatine-remodelleringscomplexen; mogelijk niet geschikt voor situaties waarin er aanzienlijke leeftijdsverschillen zijn tussen proefpersonen. |
| α-tubuline | 55 | Niet geschikt voor situaties waarin er significante leeftijdsverschillen zijn tussen proefpersonen. De expressie van tubuline verandert met antimicrobiële en antimitotische medicijnen, dus het is niet geschikt bij het toevoegen van antikanker- en antischimmelmedicijnen. | |
| β-tubuline | 55 | ||
| GAPDH | 36 | Celhypoxie zal de expressie van GAPDH doen toenemen, dus het is niet geschikt voor studies gerelateerd aan zuurstof. Factoren zoals diabetes kunnen leiden tot verhoogde expressie van GAPDH. | |
| Vinculine | 117 | Kan worden gebruikt voor eiwitten met een groot moleculair gewicht. | |
| Mitochondriën | COXIV-serie | 15-17 | Deze reeks eiwitten is voornamelijk geconcentreerd op 15-17KDa. Als het moleculair gewicht van het doeleiwit dichtbij is, overweeg dan andere ladingcontrole-antilichamen. |
| HSP60 | 60 |
| |
| Kern | VDAC1/2 | 31-37 | Deze reeks eiwitten is voornamelijk geconcentreerd bij 31-37 kDa. |
| Laminaat B1 | 66 | Niet geschikt voor embryonale stamcellen, niet geschikt als laadcontrole in apoptose-experimenten. | |
| PCNA | 36 | Niet geschikt voor niet-prolifererende cellen. | |
| TBP | 33-43 | TBP bedraagt 37-43 kDa bij mensen en 33-36 kDa bij muizen en ratten, niet geschikt voor apoptose-experimenten. | |
| JJ1 | 65-70 |
| |
| Histon H3 | 17 | De meeste eiwitten hebben een moleculair gewicht van ongeveer 17KDa. Als het moleculair gewicht van het doeleiwit dichtbij ligt, overweeg dan andere loadong control-antilichamen. | |
| Volbloed, serum, plasma | Transferrine | 77 | De expressie van genen wordt beïnvloed door bepaalde ziektebeelden en behandelingen, zoals retinoïnezuur. |
| Albumine | 66 | Het gehalte is extreem hoog. Let op dat u de monsterbelasting bij WB-experimenten beperkt. |
Labelantilichamen werken beter als ze samen worden gebruikt
Bij experimenten die eiwitinteracties bestuderen, zoals pull-down, kunnen epitope tags worden gefuseerd aan de N- of C-terminus van het doeleiwit door middel van moleculair biologische methoden. Veelgebruikte epitope tags zijn His, HA, Myc en GST. Deze epitope tags hebben doorgaans geen invloed op de biologische activiteit en intracellulaire lokalisatie van het doeleiwit. De opkomst van epitope tags heeft gemak geboden voor wetenschappelijk onderzoek en industriële productie.
| Epitoop-tag | Tag-reeks | Moleculair gewicht (KDa) |
| HA-tag | YPYDVPDYA | 1.1 |
| Mijnc-tag | EQKLISEEDL | 1.2 |
| Vlag Tag | VERDOMME | 1 |
| GST-tag | - | 26 |
| GFP-tag | - | 26.9 |
| V5-tag | GKPIPNPLLGLDST | 1.4 |
| Hert | KETAAAKFERQHMDS | 1.8 |
| E-tag | GAPVPYPDPLEPR | 1.4 |
Productinformatie
| Type | Productnaam | Moleculair gewicht (KDa) | Productnummer |
| Laadcontrole-antilichaam | β-actine, muis mAb | 42 | 30101ES |
| β-actine, Konijn pAb | 42 | 30102ES | |
| GAPDH (kloon:1A6), muis mAb | 36 | 30201ES | |
| GAPDH, Konijn pAb | 36 | 30202ES | |
| α-Tubuline, Muis mAb | 50-55 | 30304ES | |
| β-Tubuline, Muis mAb | 50-55 | 30301ES | |
| β-Tubuline, Konijn pAb | 50-55 | 30302ES |