Invoering
Luciferase reporter gene Assay Kits, als een onmisbaar kerninstrument in de ontwikkeling van geneesmiddelen, spelen een cruciale rol in belangrijke processen zoals high-throughput screening, effectiviteitsevaluatie en targetvalidatie vanwege hun vermogen om genexpressie en signaaltransductie in realtime te monitoren. De toepassing van deze technologie heeft de efficiëntie van geneesmiddelenscreening en -evaluatie aanzienlijk verbeterd, waardoor de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen is versneld.
Luciferase Reporter Gen Detectie Principe
Luciferase reportergendetectietechnologie maakt kwantitatieve analyse van vuurvliegluciferaseactiviteit mogelijk door de oxidatie van luciferine tot oxyluciferine te katalyseren en bioluminescentie te genereren. Deze technologie heeft een aanzienlijke toepassingswaarde op het gebied van miRNA-doelgenvalidatie en regulering van de transcriptionele activiteit van de promotor. Door regulerende elementen van het doelgen stroomopwaarts en stroomafwaarts van het luciferasegen in te voegen om een luciferase-reporterplasmide te construeren, kunnen cellen worden getransfecteerd en onderworpen aan overeenkomstige stimulatie of behandeling. Vervolgens kunnen door cellen te lyseren en luciferaseactiviteit te meten, de activiteitsveranderingen van regulerende elementen onder verschillende stimulatieomstandigheden worden beoordeeld, waardoor een dieper begrip van de regulerende mechanismen van genen wordt verkregen. uitdrukking.
De verschillen tussen enkelvoudige en dubbele luciferasedetectietoepassingen
Reportergen-assays worden voornamelijk onderverdeeld in single-luciferase reportergen-assays en dual-luciferase reportergen-assays. Hoe kun je in specifieke toepassingen bepalen of een experiment een single-luciferase- of dual-luciferase-detectiesysteem gebruikt? Laten we eens kijken naar de verschillen.
Enkel Luciferase Reporter Assay Systeem
Aantal reportergenen: Een enkel vuurvlieg-luciferase-reportergen;
Transfectietype: Een enkel reportergenplasmide wordt, na transfectie, gebruikt voor medicijnselectie om een stabiele reportergencellijn te construeren die luciferase tot expressie brengt;
Detectieproces: Alleen het luciferase-signaal van de vuurvlieg hoeft te worden gedetecteerd, eenvoudige bediening, korte detectieperiode, geschikt voor high-throughput geneesmiddelenscreening;
Toepassingsscenario-analyse: Het gebeurt meestal door de constructie van een stabiele overexpressie monoklonale cellijn, aangezien het expressieniveau van deze cellijnen relatief stabiel en uniform is, zonder de invloed van experimentele variaties vanwege transfectie-efficiëntie en celviabiliteit. De werking is eenvoudig en aangezien alleen het vuurvliegluciferasesignaal wordt gedetecteerd, is gegevensanalyse handiger. Gecombineerd met de voordelen van een korte detectietijd, is het met name geschikt voor high-throughput drug screening en voldoet het aan de behoeften van grootschalige monsterdetectie.
Detectiesysteem voor dual-luciferase-reportergenen
Gerapporteerde genhoeveelheid: Dubbele reportergenen van vuurvliegluciferase en Renilla-luciferase;
Transfectietype: Cotransfectie van twee reportergenplasmiden, voornamelijk door middel van transiënte transfectie;
Detectieproces: Eerst moet het vuurvliegsignaal worden gedetecteerd en vervolgens het Renilla-signaal. De verhouding tussen de twee (Firefly/Renilla) wordt gebruikt voor de uiteindelijke gegevensberekening;
Toepassingsscenario-analyse: Het gebeurt over het algemeen via transiënte transfectie, met de co-transfectie van een plasmide met het Renilla luciferase-gen als interne referentie, wat een benchmark voor het experiment biedt, waardoor de interferentie van externe factoren zoals celviabiliteit en transfectie-efficiëntie wordt verminderd. Door middel van ratioberekening is het mogelijk om variaties in celaantal, transfectie-efficiëntie en celactiviteit te corrigeren, waardoor de nauwkeurigheid van experimentele resultaten wordt verbeterd. Het is een belangrijk hulpmiddel op het gebied van genexpressieregulatie, signaaltransductiepaden en geneesmiddelenscreening.
productserie
| productnaam | Bio-Een Stap | Een vaste stap | Bright-One Stap |
| Productcode | |||
| Toepassingsscenario's en kenmerken | Deze kit slaat een relatieve balans tussen signaalintensiteit en stabiliteit. Het handhaaft een relatief hoge signaalintensiteit terwijl het de signaalintensiteit ook relatief stabiel houdt gedurende een bepaalde periode. | De halfwaardetijd kan meer dan 5 uur duren. Vooral binnen de eerste 2 uur zijn de veranderingen in de luminescentiewaarde minimaal. Het is geschikt voor ultrahoge doorvoer of 384-wells plaat assays. | Hoge gevoeligheid en hoge signaalintensiteit. Geschikt voor experimenten die een hoge gevoeligheid vereisen. |
| Signaalhalfwaardetijd | 60 minuten | 5 uur | 30 minuten |
| Operationele kenmerken | Eén stap | Eén stap | Eén stap |
Productvoordelen
Lange signaalhalfwaardetijd: De signaalhalfwaardetijd kan oplopen tot 5 uur. Daarmee wordt voldaan aan de behoeften van experimenten met een hoge doorvoersnelheid. Signaalverschillen die worden veroorzaakt door het tijdsverschil tussen de eerste en laatste putjes als gevolg van een groot aantal monsters, worden vermeden. Hierdoor worden stabielere en betrouwbaardere resultaten gegarandeerd.
Sterk fluorescentiesignaal: De signaalwaarde kan 8 ordegroottes bereiken, wat een groot detectievenster en sterke dataondersteuning biedt voor vroege medicijnscreening en effectiviteitsevaluatie.
Eenvoudige bediening: Eénstapsbediening vermijdt ingewikkelde experimentele procedures. Voeg gewoon het detectiereagens toe en wacht 5 minuten voordat u de machine start voor detectie.
Meerdere keuzes: Afhankelijk van de toepassingsscenario's zijn er 3 verschillende producten beschikbaar, die kunnen worden geselecteerd op basis van de experimentele vereisten voor signaalwaarde en signaalstabiliteit.
Productgegevens
01 Vergelijking van prestaties voor
De verificatie van drie soorten assaykits werd uitgevoerd op cellijnen die op stabiele wijze vuurvliegluciferase tot expressie brachten, en de resultaten lieten zien dat het Bright-One Step-product hogere signaalwaarden heeft; het Steady-One Step-product heeft een langere signaalhalfwaardetijd en stabielere signalen; het Bio-One Step-product heeft niet alleen hoge signaalwaarden, maar behoudt ook een langere signaalhalfwaardetijd.
Figuur 1. Vergelijking van de prestaties voor verschillende
02
Bij gebruik
Figuur 2. Vergelijking van
03
Figuur 3.Herhaalde vries-dooitest van
Operationele procedure
01 Celtransfectie
Voeg het reagens rechtstreeks toe aan de celsuspensie en pipetteer vervolgens 5 keer op en neer om een goede menging te garanderen. Wacht 5 minuten zodat de cellen volledig kunnen lysisen.
02 Monster laden
Pipetteer 100 μL van het mengsel (detectiereagens + celkweekmedium) in elke well van de detectieplaat.
03 Fluorescentiedetectie
Stel de parameters in op de plaatlezer. Plaats de detectieplaat in de plaatlezer, laat deze een paar seconden trillen en ga dan verder met de detectie.
Productlijst
| Productcategorie
| Productnaam | Productcode | Productspecificaties |
| Luciferase Reporter Gen Assay Kit | 11411ES60/80/81 | 100T/10×100T/1000T | |
| 11413ES60/80/81 | 100T/10×100T/1000T | ||
| 11412ES60/80/81 | 100T/10×100T/1000T | ||
| Dual-Luciferase Reporter Gen Assay Kit
| 11402ES60/80 | 100T/1000T | |
| 11405ES60/80 | 100T/1000T |