1 Het werkingsprincipe van geneticomycine

Genetomycine (Geneticine, G418) is een aminoglycoside antibioticum dat de eiwitsynthese remt door de verlenging van de peptideketen te blokkeren door te binden aan de 70S en 80S ribosomen in prokaryotische en eukaryotische cellen. Dit mechanisme is giftig voor onder andere bacteriën, gist, planten en zoogdiercellen. Wanneer de cellen succesvol werden getransfecteerd en geïntegreerd met een neomycineresistentiegen (zoals het neo-gen), kon de gen-gecodeerde aminoglycoside fosfotransferase (APH (3) II) G418 covalent modificeren om het te inactiveren, waardoor resistentie werd verleend aan cellen die werden gekweekt in selectief medium dat G418 bevatte.

In moleculair genetische testen is G418 een van de meest gebruikte testen voor stabiele transfectie.

2 De toepassing van geneomycine

2.1 Screening van stabiele getransfecteerde cellijnen

• G418 werd gebruikt om te screenen op cellen die resistentiegenen bevatten (bijv. neo-genen) door de eiwitsynthese te remmen. De aminoglycosidefosfotransferase die door het resistentiegen wordt gecodeerd, inactiveert G418, wat celresistentie tegen G418 verleent. Normaal gesproken is het screeningsbereik voor zoogdiercellen 200 - 2000 μg/mL, met de meest gebruikte werkconcentratie van 100 - 700 μ g / ml. Waar plantencellen 10-100 μg/mL zijn en gistcellen 500-1000 μ g / ml, zijn de volgende concentraties gebruikt voor sommige celtypen met G418 als referentie.

Cel	Sollicitatie	Activeringsconcentratie van geneomycine (μg/ml)	Geciteerde werken
Mucor-soorten	a) Gekweekt in groeimedium b) Gekweekt op gevriesdroogde bacteriën	a) 10 μg/ml b) 30 μg/ml	Hirth, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 7356-7360 (1982).
Zoogdier	a) Voor screening b) Voor het behoud van de groei	a) 400 -1000 μg/ml b) 200 μg/ml	Kanaäni en Berg, Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 5166-5170 (1982).
Plant	a) Voor screening b) Voor het behoud van de groei	a) 25-50 μg/ml b) 10 μg/ml	Ursic, et al., Biochem. Biofys. Res. Comm., vs. 101:3, 1031-1037 (1981).
Gist	a) Voor screening b) Voor het behoud van de groei	a) 500 μg/ml b) 125-200 μg/ml	Jimenez en Davies, Natuur, v. 287, 869-871 (1980).
Bacteriën	Voor screening	16 μg/ml	Waitz, et al., Antimicrobiële middelen Chemother., vs. 6:5, 579-581 (1974).

2.2 Genknockout en genoverdracht

• Bij gen knockout kan G418 worden gebruikt om cellen te screenen die het doelgen succesvol knockouten. Bij gentransfer faciliteert G418 de integratie van vreemde genen in het genoom van gastheercellen.

2.3 Resistentieselectie in celcultuur

• Tijdens de celkweek wordt G418 gebruikt om cellen te screenen die resistent zijn tegen het antibioticum. Deze cellen dragen vaak specifieke resistentiegenen.

3 Relevante experimentele procedures voor geneomycine

3.1 Bereiding van G418-stamoplossing (50 mg/ml, actieve concentratie)

1) Conversie van activiteitseenheden

Converteer met behulp van de formule: (1000/A0) × A1 = A2, waarbij A0 de potentie van G418 is, die per batch verschilt. Raadpleeg het kwaliteitscontrolerapport voor de overeenkomstige batch of het etiket op de fles. A1 is de gewenste actieve concentratie van G418 die moet worden bereid. A2 is de werkelijke poeder-tot-volumeconcentratie die moet worden gewogen.

Als de batch G418 bijvoorbeeld een potentie heeft van 750 U/mg en u wilt een actieve concentratie van 50 mg/ml bereiden, dan is de werkelijke poederconcentratie die moet worden bereid 1000/750 × 50 mg/ml = 66,67 mg/ml.

Als u 10 ml G418-stamoplossing (actieve concentratie, 50 mg/ml) bereidt, is 666,7 mg poeder nodig.

• Sterilisatie en opslag

Voeg het poedergewicht, verkregen uit de bovenstaande omrekening, toe aan 10 ml steriel gedemineraliseerd water tot het volledig is opgelost.

Maak eerst een 0,22 μm spuitfilter nat met 5 ml steriel gedemineraliseerd water, verwijder al het water. Filter vervolgens met dit filter om te steriliseren en verdeel in kleine volumes voor eenmalig gebruik (bijv. 1 ml) en bewaar bij -20 °C voor 1 jaar stabiliteit.

3.2 Vaststelling van de Kill Curve

1) Dag één: Plaats ongetransformeerde cellen bij een celdichtheid van 20-25% in geschikte kweekplaten en incubeer ze een nacht bij 37°C, CO₂.

2) Stel een concentratiegradiënt in binnen een geschikt bereik op basis van het celtype en selecteer minimaal 6 concentraties (G418 is het meest actief tegen cellen in de delingsfase, dus cellen moeten gedurende een bepaalde periode worden gekweekt voordat G418 wordt toegevoegd). Stel voor zoogdiercellen bijvoorbeeld 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/ml in.

3) Dag twee: Verwijder het oude kweekmedium en vervang het door vers bereid medium met de overeenkomstige concentratie van het medicijn, met drie replicaties voor elke concentratie.

4) Vervang het medium elke 3-4 dagen met nieuw medium dat het medicijn bevat.

5) Voer tellingen van levende cellen uit op vaste intervallen (bijv. elke 2 dagen) om de juiste concentratie te bepalen die de groei van niet-getransfecteerde cellen voorkomt. Selecteer de laagste concentratie die de meerderheid van de cellen binnen het ideale aantal dagen (meestal 7-10 dagen) kan doden als de werkconcentratie voor stabiele getransfecteerde cellijnscreening.

3.3 Screening van stabiele getransfecteerde cellen

• De G418 Geneticin (60220ES) van Yisheng Biotech heeft een werkzaamheid van ≥720 U/mg, een zuiverheid van ~98% en batchstabiliteit. De prijs is bijna een derde van die van de G418-producten van andere bedrijven.
• Het screeningmedium met de medicijnen werd elke 3-4 dagen vervangen.
• De vorming van celklonen (kolonies) werd waargenomen en beoordeeld na 7 dagen selectie. Het kan een week of langer duren voordat kolonies zich vormen, afhankelijk van het type gastheercel, transfectie en screeningseffectiviteit.
• Vijf tot tien resistente klonen werden geselecteerd en overgebracht naar 35 mm celkweekplaten en vervolgens gedurende zeven dagen bewaard in screeningmedium dat het geneesmiddel bevatte.
• Na het veranderen van de normale mediumcultuur.

4 Productaanbeveling

De G418 Geneticin (60220ES) geleverd door Yeasen Biotech heeft een werkzaamheid van ≥720 U/mg, een zuiverheid van ~98% en batchstabiliteit, terwijl de prijs bijna een derde is van die van de G418-producten van andere bedrijven.

Specificatie	S*	T*	Yeasen	Yeasen voordeel
Inhoud (HPLC)	/	/	~98%	Hoge zuiverheid
Potentie (U/mg)	≥720 µg/mg	707-721 µg/mg	≥720 µg/mg	Hoge effectiviteit
Prijs ($/5 gram)	~1000	~1000	~200	Goedkoop

5 Experimenteel geval

Bij E. coli waren G69 en G99 twee verschillende batches; de concentraties genomycine waren respectievelijk 8 mg/l, 12 mg/l en 16 mg/l, en de effectieve minimumconcentratie was 16 mg/l, waardoor de groei van diverse bacteriën volledig werd geremd.