Over T4 DNA Ligase
T4 DNA Ligase kent echter nog steeds enkele uitdagingen in praktische toepassingen, waaronder slechte stabiliteit, hoge adapter-adapter ligatie of lage DNA bibliotheek opbrengst. Deze problemen kunnen leiden tot verminderde experimentele efficiëntie, verminderde datakwaliteit, slechte herhaalbaarheid van experimentele resultaten en lage productzuiverheid, wat de algehele effectiviteit van moleculair biologische experimenten en de nauwkeurigheid van sequentiedata beïnvloedt. Om deze problemen aan te pakken, Yeasen, gebaseerd op de innovatieve ZymeEditor van haar dochteronderneming Molefuture™ Enzyme Evolution Platform heeft enzymevolutie uitgevoerd op de T4 DNA-ligase.
Figuur 1 Schematisch diagram van het reactieprincipe van T4 DNA-ligase[1]
Iteratieve natte en droge experimentele screening om een hoogwaardige T4 DNA-ligase te verkrijgen
T4 DNA-ligase, een ATP-afhankelijk ligase-enzym, omvat een compact-helical DNA-bindend domein (DBD), een nucleotidyl-transferase (NTase) domein en een OB-fold domein. Gebaseerd op de eiwitstructuur, Yeasen'S team analyseerde de residuen die afstanden van 5 tot 20Å overspannen rond het DNA-substraat, gevolgd door in silico-screening en structuur-functieanalyse met behulp van geavanceerde computationele hulpmiddelen. Tijdens dit proces analyseerde het team observeerde een flexibele lus die zich op afstand van de actieve pocket bevond. Geleid door energieberekeningen, het team ontworpen afkappingen in dit lusgebied, met de hypothese dat het de ligatiefunctie niet significant zou kunnen beïnvloeden, maar wel de algehele structurele stabiliteit zou kunnen beïnvloeden. Verder heeft het team afgestemde consensussequenties om mutanten te ontwerpen, waarbij deze analyse werd gekoppeld aan structureel-functionele overwegingen, zoals geïllustreerd in de onderstaande afbeelding.
Figuur 2 Structuur van T4 DNA-ligase
Naast rationeel ontwerp werd de gerichte evolutie van T4 DNA-ligase uitgevoerd met de MTPS-methode door de stabiliteit, activiteit en resterende activiteit te screenen. En een bibliotheek van meer dan 104 mutanten werd gescreend. Na een grondige analyse van mutatiegegevens werden veelbelovende kandidaten geselecteerd voor zuivering en rigoureuze tests. Vervolgens ondergingen alle winnaars die waren verkregen door rationeel ontwerp en gerichte evolutie een gedetailleerde karakterisering na verfijnde zuivering, met inbegrip van beoordelingen van activiteit, stabiliteit, adapter-zelfligatie, DNA-fragment-zelfligatie en DNA-opbrengst. Op basis van G1-mutanten, het team voerden DNA-shuffling en gecombineerd gericht mutatieontwerp uit om uitzonderlijke mutanten te verkrijgen die voldoen aan uiteenlopende toepassingsvereisten.
Van mutant tot marktproduct met meerdere rondes van sequentievalidatie
De ZymeEditorTM Het Enzyme Evolution Platform heeft met succes een T4 DNA-ligasemutant ontwikkeld met een hoge thermische stabiliteit, een hoge bibliotheekopbrengst en een lage adapter-zelfligatie via enzymevolutietechnologie. De momenteel verbeterde T4 DNA Ligase is succesvol gelanceerd: Hieff® Versatile T4 DNA Ligase (600 U/μL) (Cat.nr. 12996ES). Dit product presteert beter dan de traditionele wildtype T4 DNA-ligase wat betreft ligatie-efficiëntie en thermische stabiliteit. Het is geverifieerd door middel van high-throughput sequencing, wat een uitstekende kwaliteit garandeert.
Gegevenspresentatie
1. Hogere thermische stabiliteit
De T4 DNA Ligase mutanten van Yeasen werden onderworpen aan een warmtebehandeling bij 42℃ gedurende 0, 2 en 4 uur en werden vergeleken met T4 DNA-ligases van leverancier Q, N, A en T.Vervolgens werd een volledige genoom-DNA-bibliotheek geconstrueerd met behulp van 1 µg gefragmenteerd bovien gDNA met de Yeasen DNA Library Construction Kit (Cat#12927ES) om de thermische stabiliteit van de T4 DNA Ligase te vergelijken.
Figuur 3 Thermische stabiliteitstest bij 42℃
Resultaten:
Thermische stabiliteit: Yeasen ≈ Leverancier N ≈ Leverancier A > Leverancier T > Leverancier Q.
2. Hogere bibliotheekopbrengst
De T4 DNA Ligase mutant van Yeasen werd getest op bibliotheekopbrengst bij zowel hoge als lage DNA-invoerniveaus, vergeleken met T4 DNA-ligases van leverancier Q, N, A en T. De Yeasen Er werd gebruikgemaakt van de DNA Library Construction Kit (Cat#12927ES), waarbij 1 µg en 0,5 ng gefragmenteerd bovien gDNA als input werd gebruikt om DNA-bibliotheken te construeren.
Figuur 4 DNA-bibliotheekopbrengstanalyse
Resultaten:
Bibliotheekopbrengst (1 µg gDNA): Yeasen > Leverancier Q ≈ Leverancier T ≈ Leverancier A > Leverancier N.Bibliotheekopbrengst (0,5 µg gDNA): Yeasen ≈ Leverancier Q ≈ Leverancier A ≈ Leverancier T > Leverancier N.
3. Onderste adapter zelfligerend
De T4 DNA Ligase mutant van Yeasen werd vergeleken met T4 DNA-ligases van leverancier Q, N, A en T voor adapter-zelfligatie. De Yeasen Er werd gebruikgemaakt van de DNA Library Construction Kit (Cat#12927ES), waarbij 0 ng en 0,5 ng gefragmenteerd bovien gDNA als input dienden om volledige genoom-DNA-bibliotheken te construeren.
Figuur 5 Adapter zelfligatiegegevens met 0 ng (links) en 0,5 ng (rechts) gDNA-invoer
Resultaten:
1) Snelheid van zelfligatie van adapter (0 ng gDNA): Leverancier N > Yeasen > Leverancier T > Leverancier A > Leverancier Q.
2) Snelheid van zelfligatie van de adapter (0,5 ng gDNA): Yeasen > Leverancier T > Leverancier Q ≈ Leverancier N > Leverancier A.
Neem contact met ons op
Yeasen heeft met succes de beperkingen van traditionele T4 DNA-ligases overwonnen en biedt een T4 DNA-ligaseproduct dat uitblinkt in thermische stabiliteit, bibliotheekopbrengst en adapter-zelfligatie. In dit proces heeft het bedrijf een rijke bibliotheek met mutanten verzameld, waardoor onderzoekers verschillende opties hebben om aan verschillende experimentele behoeften te voldoen. Als u geïnteresseerd bent in onze producten of T4 DNA-ligasemutanten, neem dan gerust contact met ons op via de volgende methoden. E-mailadres: order1@yeasen.com (ONS)
Telefoon: +1 240-472-6069 (VS)
Aanvullend, Yeasen biedt een reeks T4 DNA-ligase-productseries. Klik op de productlink om productinformatie op te vragen
Yeasen T4 DNA Ligase-productserie
| productpositionering | Productnaam | Cat.nr. |
| Hoge thermische stabiliteit en lage zelfligatiesnelheid | Hieff® Veelzijdige T4 DNA-ligase (600 U/μL) | 12996ES |
| Snelle en efficiënte ligatie, weinig residu, perfect geschikt voor de detectie van ziekteverwekkers. | Snelle T4 DNA-ligase (400 U/µL) | 10299ES |
| universeel model | Snelle T4 DNA-ligase (400 U/µL) | 10301ES |
Referenties
[1] Shuman S.DNA-ligases: vooruitgang en vooruitzichten[J]Tijdschrift voor biologische chemie, 2009, 284(26):17365-17369.
